[发明专利]一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法，其特征在于，所述油乳剂蛋白亚单位疫苗包括一种抗原蛋白和油佐剂，所述油佐剂为ISA 201 VG、ISA 35 VG或白油；所述检测方法包括以下步骤：

1)使用冷丙酮沉淀所述油乳剂蛋白亚单位疫苗中的蛋白，其中，所述冷丙酮为丙酮置于﹣20℃冰箱预冷处理2h以上获得；所述使用冷丙酮沉淀所述油乳剂蛋白亚单位疫苗中的蛋白包括以下步骤：

a)取理论蛋白含量为2～10μg的所述油乳剂蛋白亚单位疫苗于1.5ml EP管中，根据所取所述油乳剂蛋白亚单位疫苗的体积加入冷丙酮，其中冷丙酮与所述油乳剂蛋白亚单位疫苗的体积比为9:1，放入﹣20℃处理至少1h；

b)将a)中样品12,000rpm，4℃，离心20min，去除上层液体，留沉淀，待丙酮挥发干燥之后，加入20μl PBS重悬；

c)重悬后每管加入5μl 5*loading buffer，沸水中蒸煮10min；12,000rpm，4℃离心5min，待用；

2)SDS-PAGE电泳；

3)将凝胶置于常规成像仪进行拍摄，保存图片；

4)将步骤3)中图片置于常规灰度扫描仪中，使用软件定义标准蛋白条带的灰度为1，由此得到样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果，再将样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果×标准蛋白的含量，从而得到样品蛋白的含量；以及

5)将步骤3)中图片置于常规灰度扫描仪中，使用软件选中样品蛋白条带所在的泳道，再对该泳道的所有条带进行灰度扫描，从而得到样品蛋白条带相对于样品中所有蛋白条带的比值，该比值为样品蛋白纯度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准蛋白的含量为2～10μg。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述SDS-PAGE电泳包括以下步骤：

(1)将制备好的聚丙烯酰胺凝胶用电泳夹固定至电泳槽中；

(2)将10×Tris-Glycine Buffer稀释到1×，倒入电泳槽内，电泳缓冲液液面需没过短板，低于长版；

(3)上样：Marker点样量为5μl，对照蛋白点样量为25μl，准备的样品全部加到样品槽中；

(4)点样完毕后，按红/黑颜色指示标志正确盖上盖子，80-100V恒压跑浓缩胶，120-150V恒压跑分离胶；

(5)待溴酚蓝指示剂跑至电泳板下端5mm时，关掉电源，停止跑胶；

(6)考马斯亮蓝染色：将凝胶从玻璃板中小心剥出，浸入考马斯亮蓝染色液中，液面能覆盖凝胶表面即可，置于摇床染色1h；

(7)脱色：将使用过的染色液倒入专用的回收瓶中，用自来水漂洗凝胶3次；将凝胶浸入适量的脱色液中，置于摇床上脱色至凝胶背景透明，能清晰观察到蛋白条带为止。

4.一种使用如权利要求1-3任意权利要求所述的检测方法在制备油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原含量和纯度的检测中的应用。