[发明专利]抗PCSK9单克隆抗体

说明书

本发明涉及抗体工程技术领域，具体公开了抗PCSK9的单克隆抗体。本发明包含编码所述抗体可变区和CDR区的氨基酸序列，以及获得方法和单克隆抗体的用途。本发明从噬菌体抗体库中筛选出抗PCSK9的单克隆抗体，通过链置换构建噬菌体库的方法进行亲和力成熟，先对初筛获得的单克隆抗体的轻链CDR1、2、3区突变建库筛选后，选取亲和力较高的单克隆抗体，再对其重链CDR1、2、3区突变建库进行筛选，最终筛选到了高亲和力的抗PCSK9的单克隆抗体。本发明所得到的PCSK9抗体对PCSK9具有良好的亲和力并能够抑制PCSK9与其配体的结合，可用于血脂异常、心脑血管疾病和血栓闭塞性疾病的治疗。

技术领域

本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及本发明涉及全人源的抗PCSK9的单克隆抗体、及其获得方法与应用。

背景技术

PCSK9(前蛋白转化酶枯草溶菌素9，Proprotein convertase subtilisin/kexintype 9)属于前蛋白转化酶家族蛋白酶K亚家族。人PCSK9基因定位于染色体1p32.3，长约22kb，共有12个外显子，编码含692个氨基酸残基的蛋白质。PCSK9蛋白由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域(V结构域)组成，它作为可溶性的74kDa的前体合成，在内质网中经过自身催化裂解产生14kDa的前肽和60kDa的成熟的蛋白酶。PCSK 9主要在肝脏、肠道和肾脏表达，皮肤和神经系统也有少量表达，但是只有肝脏中的PCSK9可以分泌到血液循环系统中。

研究表明，PCSK9能介导低密度脂蛋白受体(LDLR)降解从而调节血浆中LDL胆固醇(LDL-C)水平，而LDLR介导肝内的LDL胞吞过程是从循环系统中清除LDL的主要途径。LDLR是1个多结构域的蛋白，胞外域与表皮生长因子前体同源结构域EGF-A、EGF-B、EGF-C紧连。PCSK9介导LDLR降解首先需要与LDLR结合，LDLR上结合位点主要是EGF-A，形成PCSK9与EGF-A复合物。有研究表明，PCSK9也可通过极低密度脂蛋白受体、载脂蛋白B受体、载脂蛋白E受体2调节胆固醇代谢，但其中的分子机制并不明确。

基础研究和临床试验表明，通过外源性的干预措施抑制PCSK9活性，可以加速血浆中LDL的清除，从而达到降血脂的作用。目前PCSK9的抑制剂主要包括单克隆抗体、反义核苷酸、小分子干扰RNA、模拟肽和小分子抑制剂等。

单克隆抗体药物是今年生物医药领域的研发热点，具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向。以PCSK9为靶标的单克隆抗体可以与PCSK9发生特异性结合，阻断PCSK9与LDLR的相互作用，减慢LDLR的降解过程从而发挥降低LDL-C水平的作用。临床实验数据显示了抗PCSK9单抗药物的安全性、有效性及独特的临床应用价值。

全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向。抗体库技术的出现为人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到高亲和力特异的抗体。