[发明专利]一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺高分子纳米药物载体的方法

权利要求书

1.一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺接枝聚琥珀酰亚胺（PSI_OAm）高分子纳米药物载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、制备PSI_OAm包被抗原和免疫原；

b、制备PSI_OAm抗体：

c、将PSI_OAm包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的PSI_OAm标准液，以PSI_OAm抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗，进行间接竞争酶联免疫分析法；

d、以PSI_OAm标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，从而定量检测出PSI_OAm的浓度；

所述步骤a具体包括以下步骤：

a-1、水解PSI_OAm，得到水解后的PSI_OAm溶液；

a-2、向水解后的PSI_OAm溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和牛血清白蛋白，20-30℃温育3-6小时后，离心分离，取沉淀分散于pH=7.4的PBS缓冲液中即得到PSI_OAm免疫原溶液；

a-3、向水解后的PSI_OAm溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和鸡卵清白蛋白，20-30℃温育3-6小时后，离心分离，取沉淀分散于pH=7.4的PBS缓冲液中即得到PSI_OAm包被抗原溶液；

a-4、将PSI_OAm免疫原溶液和PSI_OAm包被抗原溶液分别置于透析袋中，以pH=7.4的PBS缓冲液透析12-16h后收集，即可得到PSI_OAm免疫原和PSI_OAm包被抗原。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性方程为A=1.256-0.148lgC，其中A为490nm处吸光度值，C为PSI_OAm浓度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤a-1具体包括以下步骤：将浓度为60mg/mL的油胺接枝聚琥珀酰亚胺的三氯甲烷溶液0.1-0.5mL，分散在1-6mL 0.1-1mmol/L NaOH中，超声5-10min，得到的乳状溶液在50-65℃下搅拌5-15min，反应结束后离心分离，沉淀分散在1-5mL pH=7.4的PBS缓冲液中，得到水解后的PSI_OAm。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，水解后的PSI_OAm的浓度为1~10mg/mL。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步骤a-2中，水解后的PSI_OAm溶液、羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与牛血清白蛋白的比值为2mL：0.1mg：0.7mg：1mg；所述步骤a-3中，水解后的PSI_OAm溶液、羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与鸡卵清白蛋白的比值为2mL：0.1mg：0.7mg：1mg。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b具体包括以下步骤：

b-1、首次免疫：将PSI_OAm免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合后，背部皮下多点注射到动物体内，注射8~10个点，注射量为1mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；

b-2、加强免疫：将PSI_OAm免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到动物体内，注射量为1mL/只；此后每隔一周再进行一次加强免疫，期间采血测效价，直到抗体效价达到1:32000，进行最后一次加强免疫，从动物颈动脉采血，取血清部分制得PSI_OAm抗体。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c具体包括以下步骤：

c-1、包被：用包被缓冲液将PSI_OAm包被抗原稀释100倍，包被96孔酶标板，每孔100µL，4℃冰箱过夜；

c-2、封闭：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3~5min，然后加入1wt%酪蛋白封闭，每孔200µL， 37℃温育1~2h；

c-3、加样竞争：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3~5min，然后将50µL 不同浓度的PSI_OAm标准液和50µL PSI_OAm抗体分梯度加入各孔中，37℃温育1~2h；

c-4、加酶：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3~5min，然后每孔加入100µL PBS稀释的稀释比为1/1000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37℃温育2~4h；

c-5：显色: PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3~5min，然后每孔加入100µL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃温育0.5~1h；

c-6、终止：每孔加入50µL 2mol/L的H₂SO₄终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。