[发明专利]一种喉癌细胞的核酸适配体及试剂盒

说明书

本发明公开一种核酸适配体，其序列如SEQ ID NO：1或2所示。本发明还公开了该核酸适配体的筛选方法，首先合成随机单链DNA文库和引物，再经过多轮的Cell‑SELEX筛选步骤获得核酸适配体。本发明的核酸适配体可特异性结合喉癌细胞，具有高特异性识别能力。

技术领域

本发明属于核酸适配体领域，尤其涉及一种可用于检测人喉癌细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术

喉癌是常见的头颈肿瘤之一，在呼吸道肿瘤中发病率居第二位。有国内外调查表明，喉癌的发病率不断升高，每年大约增加25％。2008年世界上男性喉癌的发病率估计为5.1/100000，男性病人死亡率约为

2.2/100000。近30年来新的外科手术方法、化疗药物及更先进的放射治疗手段已应用于喉癌的治疗中，与其他头颈癌一样，喉癌患者的总生存率并未得到提高，甚至有所下降。因此早期诊断是提高喉癌生存率的关键，而寻找早期诊断的肿瘤标志物对于胃癌的诊断和治疗则具有十分重要的意义。

核酸适配体(aptamer，也译为核酸识体、适配子)是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。目前，已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)技术；所述的SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)；相比抗体等多肽类的适配体(peptideaptamer)，核酸适配体的优势相当明显，如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。

为了能够得到能识别天然构象下膜蛋白的核酸适配体，发展了以细胞为靶标的SELEX技术，即cell-SELEX。与传统SELEX针对单一分子进行筛选不同，cell-SELEX的靶标为一个完整的活细胞。通过cell-SELEX技术已经获得了多类细胞系的核酸适配体，其中癌细胞系包括淋巴细胞性白血病细胞，骨髓性白血病细胞，肝癌细胞，小细胞肺癌细胞以及非小细胞肺癌细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人喉癌细胞株Hep-2的核酸适配体及其衍生物，还相应提供前述核酸适配体的筛选方法和应用。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以喉癌细胞株为正筛靶标，以鼻咽癌细胞株为反向筛选靶标，筛选与Hep-2特异结合的核酸适配体。

本发明提供一种特异性结合人喉癌细胞的核酸适配体的方法，包括如下步骤：

(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机文库：5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(40N)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’；上游引物：5’-FAM-ACAATGATCGAGTCGAGCAC-3’；下游引物：5’-Biotin-TGGACGGATGAGGCAAGCAG-3’；

(2)SELEX筛选特异核酸适体文库：

(3)PCR扩增文库；

(4)DNA单链文库的制备；

(5)反向筛选：以鼻咽癌细胞5-8F为对照，进行反向筛选；

(6)正向筛选；