[发明专利]应用RPA技术对转基因玉米Bt176品系特异性鉴定

说明书

技术领域

本发明涉及一种品系鉴定方法，特别涉及一种应用RPA技术对转基因玉米Bt176品系特异性鉴定。

背景技术

核酸等温扩增技术(isothermal nucleic acid amplification technology)是一种新型的扩增技术，恒定温度条件下即可进行反应，具有简便、快速、灵敏等优点，并可用于进行现场检验。RPA技术模拟了生物体内DNA的复制过程，重组酶蛋白在ATP参与下与单链DNA(引物)结合，形成DNA核蛋白微丝。该微丝牵扯周围的DNA分子，对模板DNA序列进行比对并搜索出与之匹配的序列，在单链结合蛋白的帮助下，双链模板DNA解链，引物和模板配对形成复制起始所需3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下开始复制延伸，并形成新的DNA。RPA的引物长度在35nt左右，在设计引物时应避免前后引物之间形成二级结构及引物间出现重复序等问题。在设计RPA反应的探针时，要在探针的中后部选择两个T碱基，各标记一个荧光集团(FAM和BHQ1)，在两个集团之间有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点在反应过程中被核酸外切酶识别并切割，使两个荧光集团分离产生荧光信号，特异性的探针可以实时监测荧光检测的结果。RPA荧光检测技术在20分钟内就可以完成，极大的缩短了反应时间。

转基因玉米BT176是先正达公司开发的抗虫且耐草铵膦除草剂的转基因玉米品种，是利用基因工程技术将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)亚种kurstaki的Cry1A(b)基因、土壤细菌(soil bacteria)的bar基因等外源基因导入玉米中而获得的抗玉米螟和耐草铵膦转基因品种。自1995年在美国首次准许无限制种植以来，Bt-176玉米已经在许多国家和地区大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。随后日本(1996)、加拿大(1996)、阿根廷及欧盟各成员国(1997)也先后准许无限制种植，同时，美国(1995)、加拿大(1995)、日本(1996)、及英国、丹麦、瑞士和阿根廷等国分别批准BT176玉米作为食物或饲料来源并准许上市销售。在已报道的对转基因玉米BT176检测方法中，主要是利用PCR仪在实验室中进行常规检测，也有应用于环介导的等温扩增(LAMP)技术对其进行检测，目前还没有利用RPA技术对其进行基因特异性鉴定。

发明内容

针对上述领域的空白，本发明提供了准确、快速、简便检测转基因玉米BT11品系特异性的检测方法。

一种应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一种鉴定转基因玉米BT176品系的试剂盒，包含上述的引物和探针。

一种应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的方法，提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测，如果得到扩增曲线，则证明所检样品含有转基因玉米BT176成分；如果得不到扩增曲线，则证明所检样品不含有转基因玉米BT176成分。

所述RPA快速扩增的反应体系为50μl，包括10μmol/L的引物各2μl，10μmol/L的探针0.5μl，模板DNA 50ng，缓冲溶液Buffer 29.5μl，其余用去离子水补齐。

所述RPA快速扩增及实时荧光检测的程序为：RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟；同时进行实时荧光检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明是根据外援插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米BT176成分的引物及探针组合。以转基因玉米BT176为模板，利用该对引物和探针进行荧光检测，可以得到明显的扩增曲线，以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线。将模板DNA用水稀释至1000，500，100，50，10个拷贝，结果只有10拷贝时未能扩增，其它都有扩增曲线，具有较高的灵敏度。本发明首次提供了转基因玉米BT176品系特异性的RPA检测方法。

附图说明