[发明专利]一种对细胞中X染色体定量检测的方法和试剂盒

说明书

本发明属于生物医药技术领域,涉及一种对细胞中X染色体定量的方法和试剂盒。本发明的方法包括：1)以X染色体上多个中具有多个X染色体失活特异的DNA差异甲基化位点（XIDMSs）的区域（XIDMRs）为探针，设计扩增引物；2)建立正常男性和女性样品中各探针和全X染色体的拷贝数参考值范围；和3)检测和分析未知核型细胞中X染色体数量与结构信息。本发明的试剂盒包含：1）对DNA进行亚硫酸盐转化的试剂；2）对探针区域PCR扩增的引物和试剂；以及3）对PCR扩增产物进行甲基化检测的引物和试剂。本发明可以有效地发现细胞中是否存在X染色体数量和结构异常以及异常的种类。

技术领域

本发明属于生物医药和试剂检测领域,涉及X染色体定量检测法及试剂盒。具体涉及一种对细胞中X染色体定量检测的方法以及一种基于该方法的试剂盒。尤其涉及基于X染色体失活特异的DNA差异甲基化区域的对细胞中X染色体定量检测的方法以及试剂盒。

背景技术

现有技术公开了人类体细胞中包含23对染色体，其中有22对常染色体，1对性染色体。性染色体包括X染色体和Y染色体，可以决定性别：正常男性的性染色体为XY，包含1条X染色体，而正常女性的性染色体为XX，包含2条X染色体。X染色体的数量和结构异常与多种性染色体疾病相关，包括克兰费尔特综合征（Klinefelter syndrome），特纳综合征（Turnersyndrome），X三体综合征（Trisomy X syndrome）等。对细胞中X染色体进行定量检测获取细胞中X染色体的数量与结构信息，可为多种性染色体疾病的诊断提供重要的中间结果。

现有技术方法中，核型分析可以准确获知细胞中X染色体的数量和结构信息，在临床和科研中广泛应用，但该方法需进行细胞培养，周期较长；并需要有经验的检测人员观测识别，难以大规模开展；高通量遗传检测技术，如比较基因组杂交芯片、单核苷酸多态性分型芯片和和全基因组测序技术成本较过高；常规分子遗传学检测方法，如荧光定量PCR、毛细管电泳等难以检测疾病中高发的嵌合体和结构异常情况。

研究公开了男性和女性体细胞中X染色体数量不同，需要通过剂量补偿（dosagecompensation）机制维持多数X连锁基因在不同性别间的转录水平相同或接近。在人类和哺乳动物中，这种剂量补偿是通过X染色体失活（X chromosome inactivation）完成，即女性体细胞中随机有1条X染色体处于失活状态（Xi），失活的X染色体上约有80%的基因失去转录活性；研究显示，X染色体失活发生在胚胎发育时期，非常稳定，可维持终身，其分子机制是通过表观遗传修饰，包括DNA甲基化、非编码RNA和组蛋白修饰的改变完成。X染色体失活符合n-1原则，即无论细胞中有几条X染色体，除了1条X染色体保持转录活性（Xa），其它X染色体均失活。

研究还公开了DNA甲基化参与X染色体失活过程。在人类和哺乳动物中，DNA甲基化主要是CpG二核苷酸序列上的胞嘧啶（C）碱基中5号碳原子上的氢原子（H）被一个甲基（-CH₃）取代；CpG二核苷酸在基因启动子区往往成簇存在，形成CpG岛，启动子区的CpG岛的DNA甲基化与基因的转录活性相关，通常低甲基化表明基因处于转录激活状态，高甲基化则处于转录抑制状态；在失活X染色体上，失活目标基因的启动子区处于高甲基化状态，而活化的X染色体上相应基因的启动子区则处于低甲基化状态。

有关研究通过比较男性和女性样品中X染色体上CpG位点的甲基化水平，可以鉴定X染色体失活特异的DNA差异甲基化位点（XIDMS），这些CpG位点在活化X染色体上未甲基化，而仅在失活染色体中高度甲基化，且主要定位于失活目标基因的启动子区，并成簇存在，形成X染色体失活特异的DNA差异甲基化区域（XIDMR），基于此，可通过对相关区域DNA甲基化状态的定量分析，获取细胞中X染色体的定量信息。

基于现有技术的研究现状，本申请的发明人拟提供一种对人类细胞中X染色体定量的方法，以及对人类细胞中X染色体定量检测的试剂盒。

发明内容