[发明专利]抗游离棉酚通用单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学检测分析技术领域，更具体地，涉及杂交瘤细胞株2D4及其产生的抗游离棉酚通用单克隆抗体和应用。

背景技术

棉酚(gossypol)是存在于锦葵科植物属色素腺产生的多酚萘衍生物，存在于叶和种子中。棉酚的结构为1,1’6,6’7,7’-六羟基-3,3’-二甲基-5,5’-二异丙基-2,2’-联萘-8,8’-二醛。棉酚按其存在形式可分为游离棉酚和结合棉酚两类。游离棉酚中的活性基团(醛基和羟基)可与蛋白质结合，破坏酶活，降低蛋白质消化率，导致动物生长迟缓、中毒及死亡。

棉籽榨油后棉酚部分转化为游离棉酚残留在棉籽饼粕中，平均含量为700-1920mg/kg。棉粕蛋白含量高，营养价值接近豆粕，在蛋白质原料紧缺的形势下，棉籽饼粕作为优质蛋白质原料在中国畜禽生产中应用日渐广泛，但棉籽饼粕中含有游离棉酚，如果在日粮中使用不当，容易造成动物棉酚中毒，同时人类如果食用含棉酚畜产品也存在安全风险。因此，欧盟、中国、美国等国家和地区制定了饲料、饲料原料和人类食品中棉酚含量限量标准。其中，中国现行饲料卫生标准(GB13078-2001)对于饲料中游离棉酚允许量规定为棉籽饼粕原料≤1200mg/kg。棉酚是棉籽中重要内源毒素质量参数，建立快速、高效、简便的游离棉酚检测方法能够为收购过程中质量定标提供保障。

目前检测棉籽饼粕及棉籽油中游离棉酚的方法主要包括高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、高效液相质谱联用法、分光光度法(苯胺法)、免疫化学分析法等。但是，高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、高效液相质谱联用法等运用仪器的方法虽然灵敏度较高、操作简单，但对仪器设备要求高、检测费用高，很难推广使用；分光光度法虽然普遍，但该方法存在灵敏度低、毒性大、操作费时等缺点。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，适用于大量样品的快速筛查。因此，提供对游离棉酚具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体，对于检测棉籽饼粕及棉籽油中游离棉酚具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供抗游离棉酚通用单克隆抗体杂交瘤细胞株；

本发明的另一个目的是提供有上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该抗体对游离棉酚具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立测定棉籽及其制品中游离棉酚总量的免疫学检测方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明抗游离棉酚通用单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D4已于2015年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.10872，分类命名为单克隆细胞株。

本发明抗游离棉酚通用单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.10872的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4所分泌。

上述抗游离棉酚通用单克隆抗体的杂交瘤细胞株和其所分泌的单克隆抗体均属于本发明的保护范围。

本发明所述杂交瘤细胞株或单克隆抗体可应用于检测棉籽及其制品中的游离棉酚。

进一步，本发明所述杂交瘤细胞株或单克隆抗体可用于制备用于检测棉籽及其制品中游离棉酚的药剂或试剂盒中。

本发明提供的抗游离棉酚通用单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D4的制备基本步骤为：

(1)免疫原的制备与鉴定：取醋酸棉酚溶于甲醇中，与BSA(牛血清白蛋白)溶液混合，之后加入氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)，室温下避光搅拌。之后用PBS溶液透析，分装保存；

(2)小鼠的免疫：将抗原与等量弗式佐剂混合均匀后，通过颈背部多点注射免疫BALB/c小鼠。免疫过程总共六次：首次每只100μL，间隔21天，之后二免到五免每只50ul，最后一次为腹腔冲刺免疫，每只25ul；

(3)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株2D4；

(4)杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；通过ELISA法测定IC50值。

其中，在步骤(1)中，醋酸棉酚的醛基与蛋白上的氨基发生缩合反应后，形成席夫碱，但由于碳氮双键不稳定，故又通过加入氰基硼氢化钠来还原碳氮双键为单键，使偶联产物可以稳定存在。