[发明专利]NtRLK2基因在烟草抗青枯病中的应用

说明书

本发明涉及烟草青枯病抗性相关LRR类受体蛋白激酶类基因NtRLK2的序列和功能上的应用，属于分子生物学技术领域，本发明通过基因芯片分析，获得了一个受青枯菌诱导表达上调2倍的LRR类受体蛋白激酶类基因NtRLK2部分片段，经RACE技术获得其全长cDNA序列，从烟草高抗青枯病品种系3中克隆了该基因并用于构建超表达和RNAi表达载体，转入烟草中感青枯病品种翠碧一号，接种鉴定表明该基因的RNAi干扰明显增强烟草植株对青枯菌的抗病性，初步预测该基因可能是内源抗病基因的互作基因，抑制了抗病基因的表达。这将为烟草青枯病抗病遗传育种奠定了基础。

技术领域

本发明涉及NtRLK2基因在烟草抗青枯病中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物从胚胎发生到完整的植株，整个生活史，要经历一个复杂的发育过程。这个过程由自身的遗传物质和环境共同调控。实质上，就是一个如何完成协调生活环境和自身遗传信息，使得调控基因有序的在时空表达，完成生命活动的过程。这就要求植物个体存在接收内外信号分子的受体，而蛋白激酶在这信息传导的一些列过程发挥着重要作用。真核生物的蛋白激酶通过转移ATP的磷酸基团，催化蛋白的氨基酸侧链，这种功能可被蛋白磷酸酶的作用所抵消。据估计，真核生物1%~3%功能基因都用来编码蛋白激酶。根据作用底物不同，蛋白激酶主要分为丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸两类，而酪氨酸类主要是在动物细胞中，植物类发现的大多为丝氨酸/苏氨酸类。越来越多的研究发现，植物细胞中也存在一类结构上跟动物细胞受体蛋白激酶（RPKs）相似的蛋白，称为类受体蛋白激酶（RLKs）。RLKs主要由三部分构成，即胞外结构域、跨膜区和胞内的蛋白激酶区域。

RLKs蛋白激酶由于胞外结构域的差异，各行使不同的生理功能。如属于Lectin类RLK的拟南芥At1g70130（命名：LecRK-b2）基因，在拟南芥种子发芽阶段响应ABA信号，并在生长的初期参与盐胁迫和渗透调节； Lectin类另外一个基因，跟花粉的发育相关。水稻中OsWAK1是一个细胞壁相关RLK类蛋白激酶，具有稻瘟病菌的抗性。拟南芥中一个LRR-RLK基因（RPK2），是一个控制花药生长的新因子。玉米中的ZmLrk-1，在胚乳发育和种子萌发时期受真菌感染诱导表达，但不受SA、茉莉酸和物理损伤诱导。油菜中，S-受体蛋白（SRKs），通过与SLG形成异二聚体复合物，与SRP胞外的受体结构结合，导致构象发生改变，继而引起胞内激酶磷酸化和去磷酸化交替变化，参与了花粉杂交不亲和的信号传导。水稻OsBISERK1的表达受4-氨基-2,1,3-苯并噻二唑（BTH）诱导上调表达，推测该基因具有防御作用。

本发明针对以上背景技术，前期对烟草经不同激素和环境胁迫处理后，获得各处理混合和相应对照混合两个样品，进行罗氏454测序获得抗逆相关unigene基础上，结合网上已发布的2.4万条烟草EST unigene，设计了当时国际上密度最高的12×135K烟草基因芯片，对烟草优良品种K326在青枯菌接种胁迫下的差异表达谱进行研究，共分离上下调2倍以上的差异基因2398个，获得一批RLKs基因，从中得到一个类受体蛋白基因（LRR receptor-like serine threonine-protein kinase）。通过RACE技术从烟草翠碧一号品种克隆了该基因全长（命名为NtRLK2），包含完整的阅读框。保守结构域与特征区域分析发现，含有胞外结构域、跨膜区和胞内激酶结构域，与RLK类激酶的结构类似，其中与水稻一个LRR-RLK类蛋白（登录号：NP_001042346）相似性为42%。进而从烟草高抗青枯病品种系3中克隆了该基因用于构建超表达和RNAi表达载体，转入烟草中感青枯病烟草品种翠碧一号，接种鉴定表明该基因的RNAi干扰明显增强植株的抗病性，初步预测该基因可能是内源抗病基因的互作基因，抑制了抗病基因的表达。这将为烟草抗青枯病的分子机理提供理论基础。

发明内容