[发明专利]一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA疫苗领域，具体而言，涉及一种分离的DNA片段、针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗、疫苗制剂、DNA疫苗的制备方法和疫苗制剂的制备方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)，又称布鲁氏杆菌病，简称布病。布病是由布鲁氏菌属细菌侵入机体后引起传染-变态反应性人畜共患的传染病。人类、家畜及动物普遍易感，人感染主要表现为发热、寒战、盗汗、全身不适等症状，而动物感染的临床症状主要是流产、不孕、生殖器官受侵害。世界动物卫生组织(OIE)已将布病列为B类动物疫病，我国也将其列为二类动物疫病。近年来，布病的人畜疫情在我国和世界其他国家和地区出现回升势头。中国疾病预防控制信息系统的数据表明，2004年以后，我国布病发病率不断上升，至2009年我国人间布病已报告发病35816人。我国每年因布病而产生的治疗费用、误工损失以及对畜牧业造成直接、间接经济损失已经成为一笔天文数字。因此，如何防治布病已经成为当务之急。

布病的病原是布鲁氏菌(Brucella)，属于革兰氏阴性菌，无质粒、芽孢和荚膜，兼性寄生于单核巨噬细胞内。该菌产生有毒性的内毒素，内毒素有致热性、致死作用和皮肤过敏原性。病菌主要经呼吸系统、消化系统、生殖系统等进入机体，随淋巴液达淋巴结，被吞噬细胞吞噬。如吞噬细胞未能将细菌杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原发病灶，随之大量细菌进入淋巴液和血液循环形成菌血症，并随血流带至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核-吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶。

根据宿主差异、生化反应特点及菌体表面的不同结构,可将布鲁氏菌分成6个不同的种,包括羊种布鲁氏菌(B.melitensis)、牛种布鲁氏菌(B.abortus)、猪种布鲁氏菌(B.suis)、绵羊种布鲁氏菌(B.ovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)；其中，羊种布鲁氏菌又包括1型、2型和3型。近年来，我国流行的布鲁氏菌主要是羊种3型布鲁氏菌，该布鲁氏菌对人、畜均有很强的毒力和侵袭力，致病力也很强，人畜感染后症状较严重，容易引起布病的爆发和流行。因此，采取有效措施防治羊种3型布鲁氏菌引起的布病对畜牧业和公共健康事业的发展至关重要。

目前，全世界范围内消灭该病的主要方法是扑杀与免疫结合，而在布病发生相对严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。现有的布鲁氏菌病疫苗主要集中在减毒活疫苗和灭活疫苗，其中，在广泛应用的疫苗主要有减毒活疫苗S19、Rev.1疫苗、羊种布鲁氏菌M5减毒活疫苗。但上述疫苗都属于传统的减毒活疫苗，仍保持一定毒力，容易出现病毒毒力回复，即“返祖现象”，存在安全性的问题。另外，活疫苗须在低温条件下保存及运输，对保存和运输的要求较高。

为了克服常规疫苗存在残余毒力等缺陷，科技人员也对布鲁氏菌病DNA疫苗进行研究。DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗具有接种载体(如质粒)结构简单，生产成本低，适于大批量生产、便于运输和保存、比传统疫苗更安全等优点。现有技术中已经成功制备出L7/L12、P39等DNA疫苗，但上述DNA疫苗存在诸多缺陷，例如，pCDNA3-L7/L12刺激的免疫反应只能保持较短的时间(4周)，P39真核疫苗只有较低的保护效力，在攻毒8周后免疫应答的效果才明显(log0.73)，但与传统的S19弱毒疫苗相比，还存在一定差距。总而言之，现有技术缺乏一种安全、稳定、抗体效价高、免疫效力时间长的布鲁氏菌病DNA疫苗，特别是缺少一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种分离的DNA片段，该DNA片段为分离自羊种3型布鲁氏菌的Omp31基因。

本发明的第二目的在于提供一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗，所述的DNA疫苗针对羊种3型布鲁氏菌的感染，具有安全无毒、免疫效力强、持续时间长、便于运输和保存等优点。

本发明的第三目的在于提供一种疫苗制剂。

本发明的第四目的在于提供一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗的制备方法，该制备方法简单易行，便于大规模生产。

本发明的第五目的在于提供一种疫苗制剂的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：