[发明专利]一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法。

背景技术

近年来，微生物引起的食源性疾病已经成为当今世界性公共卫生热点。在食源性致病菌中，大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7是最危险的一个，也是目前世界上公认的三大最主要的食源性致病菌之一。感染大肠杆菌O157:H7的临床症状包括腹泻、出血性肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓形成的血小板减少性紫癜等。致病性大肠杆菌可通过污染饮水、食品等途径引起疾病暴发流行，严重危害人体健康。

目前检测大肠杆菌O157:H7的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3～7天)，且整个过程需要专业人员操作，因此该方法只能用于执法部门对中毒事件的起因进行分析，以及对市场食品安全状况进行评估；免疫学尤其是免疫层析方法，不需复杂仪器设备，检测时间较快易操作，但目前该类方法总体检测灵敏度偏低(细菌浓度需达到10⁵～10⁶CFU/mL)，因此针对真实样品检测，往往需要较长的增菌时间。因此，建立快速、灵敏、稳定的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要的意义。

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering，SERS)标记技术是一种新颖的光谱标记方法，他利用金、银等贵重金属的纳米粒子来增强吸附在其表面的标记分子的拉曼信号，并将其作为标记示踪信号。SERS标记技术具有如下的优点，拉曼光谱谱峰窄、拉曼散射几乎不受水的影响、SERS信号强、低背景、基本不受光漂白的影响且不易发生淬灭现象、具有超高的灵敏性和选择性等。基于SERS技术而发展起来的纳米探针在生物成像、蛋白质检测、肿瘤识别等诸多领域展现出可观的应用前景。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法。本发明采用二氧化硅包裹金纳米微球集成免疫磁珠捕获技术快速定量检测致病菌(如：大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7))。

本发明的方法具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、检测过程简单快速、准确定量等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，包括如下步骤：

(1)将拉曼信号分子结合到金纳米颗粒表面，随后通过氨水还原正硅酸乙酯(TEOS)的方法在结合了拉曼信号分子的金纳米颗粒表面形成二氧化硅薄层，以保证拉曼信号分子的稳定性；

(2)通过硅烷偶联剂将巯基修饰在步骤(1)中制备好的硅层上，再通过中间体将致病菌抗体修饰在该颗粒表面，用牛血清蛋白(BSA)封闭剩余活性位点，制备成拉曼信号探针；

(3)采用活化剂活化表面修饰有羧基的磁珠，随后加入致病菌抗体和BSA制备成磁性纳米颗粒，即捕获探针；

(4)将培养好的致病菌离心后用水重悬，并稀释成一组具有浓度梯度的标准样品液；

(5)取相同体积的步骤(3)中的捕获探针，分别加入步骤(4)不同浓度的标准样品液，室温中孵育，磁分离后去掉上清液；再将步骤(2)中的拉曼信号探针加入，形成“捕获探针-致病菌-信号探针”的“三明治”结构；磁分离后，对上清液中剩余的拉曼信号探针进行信号采集；

(6)根据致病菌浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对致病菌进行定量检测；

在上述检测致病菌的方法中：

所述的致病菌优选为大肠杆菌(E.coli)O157:H7；

步骤(2)、(3)中所述的致病菌抗体优选为大肠杆菌(E.coli)O157:H7抗体；

步骤(1)中所述的拉曼信号分子优选为4,4′-联吡啶，该分子一端连接在胶体金表面，另一端与抗体相连，是双官能团标记分子；

步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径优选为25nm～35nm；优选为30nm；

步骤(1)中所述的氨水还原正硅酸乙酯的方法是在异丙醇的水溶液中进行；

步骤(2)中所述的硅烷偶联剂是(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)，通过偶联作用将巯基修饰在硅层上；

步骤(2)中所述的中间体是3-硫代-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐(sulfo-SMCC)，其中一端马来酰亚胺接在硅层的巯基上，另一端琥珀酰亚胺用来连接致病菌抗体；