[发明专利]一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法

权利要求书

1.一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将拉曼信号分子结合到金纳米颗粒表面，随后通过氨水还原正硅酸乙酯的方法在结合了拉曼信号分子的金纳米颗粒表面形成二氧化硅薄层；

(2)通过硅烷偶联剂将巯基修饰在步骤(1)中制备好的硅层上，再通过中间体将致病菌抗体修饰在该颗粒表面，用BSA封闭剩余活性位点，制备成拉曼信号探针；

(3)采用活化剂活化表面修饰有羧基的磁珠，随后加入致病菌抗体和BSA制备成磁性纳米颗粒，即捕获探针；

(4)将培养好的致病菌离心后用水重悬，并稀释成一组具有浓度梯度的标准样品液；

(5)取相同体积的步骤(3)中的捕获探针，分别加入步骤(4)不同浓度的标准样品液，室温中孵育，磁分离后去掉上清液；再将步骤(2)中的拉曼信号探针加入，形成“捕获探针-致病菌-信号探针”的“三明治”结构；磁分离后，对上清液中剩余的拉曼信号探针进行信号采集；

(6)根据致病菌浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对致病菌进行定量检测。

2.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

所述的致病菌为大肠杆菌O157:H7；

步骤(2)、(3)中所述的致病菌抗体为大肠杆菌O157:H7抗体。

3.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的拉曼信号分子为4,4′-联吡啶；

步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径为25nm～35nm。

4.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的硅烷偶联剂是(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷；

步骤(2)中所述的中间体是3-硫代-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐；

步骤(2)中所述的致病菌抗体的浓度为0.5～1mg/mL。

5.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的表面修饰有羧基的磁珠，其粒径为100～200nm；

步骤(3)中所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。

6.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的浓度梯度为0、10、10³、10⁵、10⁷、10⁹CFU/mL，其中0CFU/mL为空白对照。

7.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的室温中孵育的时间为1～2h。

8.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的“捕获探针-致病菌-信号探针”的“三明治”结构的混合体积比例为3.5～4.5：1：4.5～5.5。

9.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得：所述的显微拉曼光谱仪的操作条件为激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为10～60s。

10.根据权利要求1所述的基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的信号是选取拉曼信号分子的特征拉曼谱峰作为定量峰，并以致病菌浓度对该谱峰光谱强度作图，并以此绘制标准曲线。