[发明专利]口腔菌群多样性的分析方法及与疾病相关的菌群标志物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体地，本发明提供了一种基于二代高通量测序技术的检测疾病患者体内口腔菌群多样性的技术和方法。

背景技术

口腔内数以亿计的微生物及其代谢产物在人体能量代谢、营养物质吸收、先天和获得性免疫、胃和口腔功能等方面发挥着重要作用,一旦宿主与口腔微生物之间共栖共生的稳态被打破,就会诱发多种人类疾病。目前已经认识到口腔微生物与人类健康和疾病的密切关系,仅仅从人类自身角度出发来研究人类疾病远远不够,必须考虑到与人类共栖共生的口腔微生物的作用。

目前应用于人体口腔微生物的多样性及差异化的研究方法较多，主要有传统检测方法、构建基因文库法、遗传指纹图谱技术、分子杂交技术和DNA测序技术等方法。其中传统微生物检测方法是用各种培养基培养分离微生物，并通过革兰染色、生物化学和血清学试验等方法来确定微生物种类，通过倍比稀释、菌落计数等方法来测定微生物数量。但由于传统微生物培养技术中，菌株的富集或衰减不可避免，原始的微生态结构被改变，这会导致研究结果存在较大偏差。

综上所述，应用和开发针对疾病患者口腔菌群的多样性及差异性的检测方法，能够为人们更好的了解口腔微生物以及疾病之间的相互关系的技术支撑和理论基础。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种针对胃癌患者口腔菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的再一个目的是提供一种通过设计特异性引物(人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补)，适用于多种类疾病患者口腔菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的又一个目的在于为人们更好的了解口腔微生物以及疾病之间的相互关系的技术支撑和理论基础。

1.在本发明中，所述引物对(上、下游引物统称为一对引物)不限于由所述序列所示的两条单链DNA分子组成的引物对，只要是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对均可。

本发明提供了一种检测胃癌患者口腔菌群的多样性及差异性的特异性引物对，其特征在于，所述引物对是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对。所述引物对是由两条单链DNA分子序列组成的引物对。所述引物对的

上游引物为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

下游引物为：5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。

所述的引物对，用于生物技术及检测领域，通过二代高通量测序技术，精准检测胃癌患者口腔菌群的多样性及差异性。

2.本发明还提供一种判定待测疾病患者体内口腔菌群的多样性及差异性的方法，其特征在于包括以下步骤，

(1)提供一待测唾液样品；

(2)从所述唾液样品中，提取其样本DNA；

(3)配置PCR反应体系，进行PCR反应；

(4)对于PCR反应产物进行目标片段的检测；

(5)对于有目的片段的PCR产物进行PCR产物纯化；

(6)以步骤5中PCR产物为检测对象，用二代高通量测序技术进行唾液样本中的微生物种类的检测；

(7)对于二代测序结果进行数据分析及处理。

3.本发明所述唾液样本的采集及唾液样本DNA的提取方法为：

(1)所述唾液样本的采集方法具体为：

1)时间最好选择在上午的9:00-11:00之间，且在取样前的1小时之内不要进食；用清水漱口；

2)漱口5分钟后，在30分钟内收集5ml唾液到一个50ml的采样管中(如果条件允许，在取样过程中，保证采养管放在冰上)，提醒患者不要咳粘液；

3)采样完成后，4℃，2600g，离心15min；弃上清液，将采样管的盖拧紧，做好信息记录，包括被采样者姓名、住院号及采样时间。

(2)所述唾液DNA提取方法具体为：

用离心后沉淀的唾液样本，选择用改进的CTAB抽提法进行样本DNA的提取。

1)打开管盖，用移液枪将采样管中的沉淀转移到1.5毫升的Ep管中，12000转速，离心5分钟。

2)加入300微克65℃预热的2×CTAB搅拌震荡为悬浊液。

3)EP管缠绕封口膜后95℃水浴加热8分钟。

4)加入300微升酚仿(取下层)混合液，振荡混匀，10000转速，离心5分钟；