[发明专利]一种环状转座子复合物及其应用

说明书

本发明公开一种环状转座子复合物，所述环状转座子复合物包含Tn5转座酶和插入DNA；所述插入DNA包含转座子末端序列、2个标签序列和含酶切位点的DNA序列。本发明进一步公开了所述环状转座子在构建DNA文库中的应用。本发明利用环状转座子复合物构建DNA文库的方法操作简便，建库效率高，仅需80分钟即可完成文库构建全程，所需的DNA量也大幅下降，1～50ng的靶DNA即足以用于建库，推动二代测序技术在生命科研与精准医疗产业的广泛应用，具有重大而深远的意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学与基因组学领域。更具体地，涉及一种环状转座子复合物及其应用。

背景技术

DNA测序(DNA sequencing)作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，无法形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的双脱氧末端终止测序法(Sanger,F.；Nicklen,S.；Coulson,A.R.(1977),DNA sequencing with chain-terminating inhibitors,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,74(12):5463–5467)，因其简单、快速，经过后续的不断改良，成为了相当一段时间内DNA测序的主流技术。

然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。与传统的Sanger测序方法相比，二代测序技术使得科学家们可以更加快速、廉价地对DNA与RNA进行测序，彻底变革了分子生物学与基因组学的研究(Quail,M.A.,I.Kozarewa,F.Smith,A.Scally,P.J.Stephens,R.Durbin,H.Swerdlow,and D.J.Turner.A large genomecenter’s improvements to the Illumina sequencing system.Nat.Methods 2008,5:1005-1010)。

标准的传统二代测序文库构建包括如下步骤：(i)片段化，(ii)末端修复，(iii)5’末端磷酸化，(iv)3’末端加dA，从而可与测序接头连接，(v)连接接头，(vi)通过PCR富集两端均成功连接接头的产物(如图1)(Steven R.Head,H.Kiyomi Komori,Sarah A.LaMere,Thomas Whisenant,Filip Van Nieuwerburgh,Daniel R.Salomon,and PhillipOrdoukhanian,Library construction for next-generation sequencing:Overviewsand challenges.BioTechniques,2014,56:61–77)。该方法步骤较多，操作繁琐，耗时费力，因而有学者对其作出改进，将步骤(ii)～(v)整合在同一反应体系中(M Neiman,SSundling,H P Hall,K Czene,et al.Library preparation and multiplexcapture for massive parallel sequencing applications made efficient andeasy.Plos One 2012,7(7):e48616-e48616)。但无论整合与否，建库过程中的3’末端加dA步骤，因为需要用Taq或exo Klenow DNA聚合酶为DNA3’端添加dA突出端，而此步骤的加3’末端dA效率较低，因此直接决定了产物两端均成功连接接头的效率较低，在很大程度上制约了建库效果。