[发明专利]一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L‑苏氨酸的方法

权利要求书

1.一株大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将出发菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的启动子P_ppc替换为6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的启动子P_zwf，从而达到能通过甜菜碱调节其L-苏氨酸生产能力的目的；

发菌株为E coli THRD，编号CGMCC No.11074；

所述启动子P_zwf序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的一株大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法如下：

(1)ppc基因启动子P_ppc上、下游同源臂ppc-up和ppc-down、Cm基因和zwf基因启动子P_zwf的扩增；

(2)构建包含上述片段的连接片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down；

(3)将上述连接片段转化入大肠杆菌THRD感受态细胞，筛选获得ppc基因启动子P_ppc被zwf基因启动子P_zwf替换的突变株。

3.一种利用权利要求1所述菌株生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，发酵过程中在发酵体系中添加0.5-1g/L的甜菜碱，从而实现L-苏氨酸产量及糖酸转化率的提高。

4.如权利要求3所述的生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，摇瓶发酵方法具体如下：

(1)将菌株进行斜面培养活化，37℃培养14-16h，转接一次，37℃培养8-10h；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为6-8；

(3)按照10％的接种量将种子培养液接种到发酵培养基中，37℃，200rpm培养，发酵过程中，缺糖后开始流加糖，甜菜碱随糖进行流加，所述流加的糖为80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜碱，每次每30mL发酵体系流加1mL，发酵28-32h结束；

所述种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20-40，酵母粉5-20，蛋白胨2-10，磷酸二氢钾0.75-2.5，硫酸镁0.25-1.0，硫酸亚铁0.005-0.02，硫酸锰0.005-0.02，V_B1 0.001-0.003，V_H0.0001-0.0005，苯酚红15-30，其余为水，pH 7.0-7.2；

所述发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖15-45，酵母粉1-5，蛋白胨1-8，磷酸二氢钾1-4，柠檬酸钠0.5-2.5，硫酸镁0.5-1.5，V_B1 0.0004-0.002，V_H 0.01-0.04，硫酸锰0.05-0.2，硫酸亚铁0.05-0.2，甜菜碱0.4-0.6，苯酚红15-30，其余为水，pH 7.0-7.2。

5.如权利要求3所述的生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，发酵罐发酵方法具体如下：

(1)将菌株进行斜面活化，37℃培养14-16h，转接一次，37℃培养8-10h；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中，37℃培养，至OD₆₀₀为12-16，按照14-18％的接种量将种子培养液转接发酵培养基；

(3)发酵过程中利用氨水调节pH为6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗尽，流加含2.5g/L的甜菜碱的80％的葡萄糖，整个发酵过程葡萄糖浓度控制在5g/L以下；

(4)发酵28-32h结束发酵；

种子培养基以g/L计：葡萄糖15-45，玉米浆20-50mL/L或干粉8-20，酵母粉1-5，硫酸镁0.15-0.5，硫酸亚铁0.005-0.025，硫酸锰0.005-0.025，磷酸二氢钾1.0-4.0，柠檬酸1.0-5.0，硫酸铵1.0-5.0，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基以g/L计：葡萄糖10-25，酵母粉1-5，玉米浆10-25mL/L或干粉4.0-10，硫酸镁0.25-1.0，硫酸亚铁0.005-0.02，硫酸锰0.005-0.02，磷酸二氢钾1.0-5.0，甜菜碱0.4-0.6，其余为水，pH 7.0-7.2。

6.权利要求1所述菌株在发酵生产L-苏氨酸中的应用。