[发明专利]一种固定化核酸酶P1及其制备方法与其应用

说明书

本发明公开了一种固定化核酸酶P₁的制备方法，包括如下步骤：(1)改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；(2)核酸酶P₁固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5~6g/L核酸酶P₁酶液中，核酸酶P₁与树脂的质量比为10~250mg：1g，混合，在25℃振荡反应时间2~12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P₁。本发明提供的表面改性介孔树脂微球固定化方法，核酸酶P₁的催化性能高，可使RNA水解率达到95%以上。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体设计一种固定化核酸酶P₁及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，由于生物催化反应具有底物特异性、反应效率高等优势而备受关注。然而生物酶在工业环境下稳定性差、耐受性差、重复利用性差及分离困难，难以实现连续化。而解决酶催化工业应用的关键技术就是固定化。

核苷酸具有很高的经济价值，广泛应用于生物医药、食品、饲料和营养保健等领域。目前生产核苷酸的方法有水解法、微生物发酵法、化学合成法及自溶法等，化学合成法着重于核苷的磷酸化，生产成本高效率低，且用到有毒的化工原料，与提倡绿色产品的理念相违背；微生物发酵法生产成本低效率高，但核苷酸生产难度较大，目前仅有肌苷酸和鸟苷酸实现了工业化生产；自溶法产物浓度低，总收率较低，提取困难；酶解法利用酶水解RNA，该方法生产核苷酸成本低、收率高、操作简单，是目前主要的核苷酸生产方法。

核酸酶P₁是一种含锌金属酶，由桔青霉发酵生成，具有磷酸二酯酶特性，能将单链DNA和RNA水解为5’-核苷酸，是核苷酸工业化生产中最常用的一种酶。研究表明游离酶利用率低、产物底物双抑制、产品分离纯化困难，导致工业生产中难以实现连续化，因此固定化酶连续生产核苷酸的研究成为重点。

树脂作为一种人工合成的介孔多聚物，具有机械强度高、稳定性好、载酶量大、易于分离、可重复使用等优点，已经被广泛用作固定化酶载体。然而该固定酶存在固定量及酶活性偏低、稳定性不够等问题，因此需要选择合适的表面修饰剂对树脂表面进行改性以提高固定化酶的固载量、酶活性及热稳定性。

伴刀豆蛋白A（ConA）作为一种凝集素，对含有甘露糖或者葡萄糖的糖蛋白具有特异性的亲和力，实现酶的定向固定化，使酶在载体表面按照一定的方向排列，使底物易进入到酶的活性位点，从而改善酶的酶学性质。利用戊二醛将ConA和载体交联在一起，然后核酸酶P₁的糖基部分和ConA连接起来，通过核酸酶P₁的糖基部分实现酶的定向固定化，没有必须氨基酸残基参与共价结合，且避免了固定化过程中由于酶分子与交联剂直接接触对酶分子造成的化学损伤。

聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型水溶性高分子化合物，由N-乙烯基吡咯烷酮在一定条件下聚合而成，由于其良好的水溶性、化学稳定性、生物相容性和生物惰性，在材料表面改性中逐渐表现出较好的应用前景。PVP改性载体表面具有良好的抗蛋白质吸附能力，选择性的吸附特定的蛋白，且PVP的包覆和空间位阻作用可抑制酶的团聚，使酶在载体表面均匀分布，进一步提高酶的稳定性。

聚乙二醇（PEG）分子末端有两个能被活化的-OH基团，能够与水形成氢键，使其具有良好的水溶性，是一种被广泛使用的化学修饰材料。PEG无毒、无免疫原性、具有良好的生物相容性，且其生物相容性已通过美国食品和药物管理局(FDA)认证。

多巴胺是一种生物神经递质，具有优良分散性、粘附性、亲水性及生物相容性等优点,在碱性有氧条件下可在几乎所有材料表面发生自聚合反应，形成一层强力黏附在固体材料表面的聚多巴胺层，成为用于酶固定化领域的一种理想材料。