[发明专利]一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，包含以下组分：(1)样本稀释液；(2)海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物；

所述海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白的氨基酸序列选自以下之一：

(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

(2)与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液组成如下：20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，5mM MgCl₂，1％Triton X-100，水余量。

3.根据权利要求1所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：

a、以OspC抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得OspC抗原基因片段；

b、将获得的OspC抗原基因片段与带海肾荧光素酶基因的pREN2载体质粒分别进行BamH1和Xbal 1双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；

c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；

d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒提取重组质粒；

e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度；

f、在10cm2细胞培养皿中培养293T细胞，当细胞铺板率达到80-90％时，以脂质体核酸转染试剂：步骤d所得重组质粒按照3μL∶1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48-72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；

g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。

4.根据权利要求3所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，步骤a中，PCR扩增的引物为：

上游引物：5′-GAGGGATCCATGAAAAAGAATACA-3′，

下游引物：5′-GAGCTCGAGTTAAGGGTTTTTTGGACTTTCT-3′。

5.根据权利要求1或2所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法：

a、proteinA/G用0.01M、pH7.4PBS溶解为1μg/mL的浓度，

b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h，

c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。

6.根据权利要求1或2所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述洗涤液配制方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g，KH₂PO₄ 0.24g，加水定容至1L，灭菌。