[发明专利]一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法

权利要求书

1.一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法，其特征在于，包括：

步骤1，配制设定浓度的荧光指示剂工作液；

步骤2，获取番茄叶片下表皮；

步骤3，将配制的所述荧光指示剂溶液装载至获取的所述番茄叶片下表皮；

步骤4，用激光扫描共聚焦显微镜对装载所述荧光指示剂溶液的所述番茄叶片下表皮进行荧光图像采集，根据所采集的荧光图像确定番茄叶片保卫细胞游离Ca²⁺浓度。

2.根据权利要求1所述的一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法，其特征在于，所述荧光指示剂采用Fluo-8AM。

3.根据权利要求1或2所述的一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法，其特征在于，所述配制荧光指示剂溶液包括：

步骤11，采用粉末状的荧光指示剂为原料；

步骤12，用二甲基亚砜溶解所述荧光指示剂，配制成1或2mM的母液；

步骤13，所述母液密封分装于-20℃避光保存；

步骤14，使用前将母液稀释成需要浓度的工作液即为荧光指示剂工作液。

4.根据权利要求3所述的一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法，其特征在于，所述步骤14中，稀释母液采用10mM的Mes-Tris，pH为6.1的缓冲液。

5.根据权利要求1或2所述的一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法，其特征在于，所述获取番茄叶片下表皮包括：。

步骤21，选取植株健壮、苗龄为4～5片真叶的番茄幼苗；

步骤22，选取步骤1选定的所述番茄幼苗从下向上数第三片真叶相同位置的小叶；

步骤23，将步骤2选取的叶片在50μM浓度的茉莉酸甲酯中孵育一小时作为前处理；

步骤24，用尖头镊子撕取所述前处理后的叶片下表皮，放置在载玻片上，然后用毛笔铺展所述表皮，用于荧光指示剂的装载。

6.根据权利要求1或2所述的一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法，其特征在于，所述将配制的所述荧光指示剂溶液装载至获取的所述番茄叶片下表皮包括：

步骤31，将荧光指示剂工作液的装载浓度配制成三个浓度，分别为5μM、10μM、15μM；

步骤32，向载玻片上铺展的所获取的番茄叶片下表皮上分别滴加三个浓度的荧光指示剂工作液，使番茄叶片下表皮浸在荧光指示剂工作液中，然后常温黑暗下孵育30min～50min；

步骤33，用Mes-Tris缓冲液洗涤步骤32的各番茄叶片下表皮三次，去除荧光指示剂工作液，室温放置20min，即完成将配制的所述荧光指示剂溶液装载至获取的所述番茄叶片下表皮上。

7.根据权利要求1或2所述的一种番茄叶片保卫细胞游离钙离子浓度的荧光指示剂检测方法，其特征在于，所述步骤4中所用的激光扫描共聚焦显微镜为Leica TCS SP5型激光扫描共聚焦显微镜。