[发明专利]基于人RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种基于人RNA聚合酶I(hPolI)系统的肠道病毒68型(EV‑D68)微复制子的构建及应用。本发明所提供微复制子是将野生型EV‑D68基因组RNA中的编码区替换为萤火虫荧光素酶(firefly‑Luciferase，f‑Luc)报告基因得到带有EV‑D68基因组全部非编码区(UTR)基因和报告基因的质粒，即EV‑D68微复制子。由于微复制子不产生具有感染性的活病毒，因此可以在普通实验室进行EV‑D68的复制调控机制研究。该微复制子不同于传统正股RNA病毒微复制子，无需体外转录，避免了RNA操作，大大简化了实验过程。利用该微复制子，EV‑D68的非编码区功能可以用报告基因检测试剂盒定性定量检测，为肠道病毒68型的病毒UTR区在致病机制和病毒复制过程中的作用机制研究以及疫苗、药物的研发提供了一个简单、快速、灵敏、安全的研究平台。

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体的，本发明公开了一种基于人RNA聚合酶I(hPolI)系统的肠道病毒68型微复制子的构建及应用。

背景技术

肠道病毒68型(EV-D68)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒D组。EV-D68基因组为单股正链RNA，长度约为7.5Kb，由单一的开放读码框(ORF)及其两侧非翻译区(5’UTR和3’UTR)构成。EV-D68基因组编码一条多聚蛋白，该蛋白被病毒自身编码的蛋白酶水解为Pl、P2和P3三种前体蛋白，其中P1被进一步加工成病毒的结构蛋白VPl～VP4；P2和P3被加工成7个非结构蛋白。

自1962年首次发现后，该病毒的分离鉴定罕有报道。1970-2005年间，在美国只有26例临床分离株被报道，占所有报道的EV家族病例的0.1％，流行病学数据极其有限。然而近年来，日本(2005-2010)，中国(2006-2012)，泰国(2006-2011)，意大利(2008-2009)，英国(2008-2010)，肯尼亚(2008-2011)，法国(2009)，菲律宾(2009-2011)，美国(2009-2010)，新西兰(2010)，荷兰(2010)都有EV-D68爆发，而且出现严重的呼吸困难，四肢瘫痪为主要症状的重症患者，甚至发现死亡的病例。患者的主要年龄群集中在一岁到四岁的儿童，但有近四分之一的感染者为成年人。因此推断，随着检测数据的增加，EV-D68最终可能被认定为全年龄组的呼吸系统病原体。因此，EV-D68引起国际卫生组织的广泛关注。但是，目前仍缺乏特效的治疗手段。因此继续深入开展相关研究，如病毒的分子生物学特征、复制机制、致病机理，将有利于人类更加全面透彻的了解EV-D68，从而设计有效的药物、准确的诊断方法以及良好的疫苗提供理论依据。

随着分子生物学的不断发展，科学家可以通过反向遗传学的手段定向改造病毒，为深入开展相关病毒的研究提供了良好的工具。

病毒微复制子是将部分的病毒基因组替换为报告基因的病毒cDNA结构。由于微复制子结构简单且为DNA形式，可方便的用于对RNA病毒顺式作用元件和反式作用蛋白质的分析，也可用于抗病毒药物的筛选。微复制子本身安全无危害，不需要特殊的实验场所和设备，为不同实验室研究病毒复制相关机制提供了一个工具。

目前，单链正股RNA病毒反向遗传系统一般基于T7 RNA聚合酶来实现，将病毒cDNA克隆于T7启动子下游，通过体外转录的方法，获得病毒的RNA，再将病毒RNA转染细胞以获得重组病毒。这种方法费时费力，并且在操作过程中有对cDNA体外转录、RNA提纯的过程，易被RNA酶污染，造成实验失败。pHH21质粒上带有人RNA聚合酶I(hPolI)启动子，可以在细胞中直接诱导转录，省去了体外转录的过程，大大节省了操作步骤。

目前尚未有对EV-D68微复制子构建的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于Pol1系统的肠道病毒68型微复制子体系及其构建方法及其应用，克服现有技术中传统的病毒感染系统时间长，病毒滴度检测繁琐，精确度低的问题。