[发明专利]基于人RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系及其构建方法

权利要求书

1.一种基于RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)公司合成EV-D68 Fermon病毒株的5’UTR cDNA；所述Fermon的5’UTR核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3为引物，PCR扩增得到肠道病毒68型毒株Fermon的5’UTR片段；

(3)以实验室保存pcDNA3.1-f-Luc质粒为模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物，PCR扩增得到f-Luc片段；

(4)以步骤(2)得到的PCR产物和步骤(3)得到的PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQID NO:7为引物进行overlapping-PCR扩增；回收混合PCR产物；

(5)以步骤(4)得到的PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8为引物进行PCR扩增；

(6)Pst1和Not1双酶切经步骤(5)得到的PCR产物和VR1012载体，连接，筛选阳性克隆；

(7)以步骤(6)得到的阳性克隆为模板，以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，PCR扩增，PCR产物经DpnI酶37℃处理30分钟，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选获得无BsmB1酶切位点的f-Luc微复制子片段；

(8)以步骤(7)得到的处理后的质粒为模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12为引物，PCR扩增得到带有BsmB1酶切位点的f-Luc微复制子片段；

(9)BsmB1酶切步骤(8)得到的PCR产物和pHH21载体，连接，筛选阳性克隆，即为RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型f-Luc微复制子；

(10)以步骤(9)得到的pHH21-EV-D68-f-Luc为模板，以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物，PCR扩增，PCR产物经DpnI酶37℃处理30分钟，转化感受态大肠杆菌DH5α，得到5’UTR108-207碱基缺失的EV-D68微复制子突变体：pHH21-EV-D68_Δ180-207-f-Luc。

2.根据权利要求1所述的基于RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述overlapping-PCR的程序为95℃30s，53℃30s，72℃1.5min，五个循环，之后95℃30s，53℃30s，72℃1min，25个循环。

3.根据权利要求1所述的基于RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系的构建方法，其特征在于，步骤(7)和(10)中所述PCR的程序为95℃20s，55℃20s，72℃5min，18个循环。

4.权利要求1-3任一项所述的基于RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系的构建方法得到的肠道病毒68型微复制子体系。

5.一种包含权利要求4所述的肠道病毒68型微复制子体系的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为DH5α。