[发明专利]斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用

权利要求书

1.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示；所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的编码蛋白，其序列如SEQ ID NO：5所示；用于扩增所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的特异性PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

2.权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的编码蛋白在制备检测家畜斯氏副柔线虫感染过程的产品中的应用。

3.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、引物设计

根据Pj_CPI的基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoR I、Xho I酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成；

步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取

按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA，具体步骤如下：

21)样品的研磨和匀浆：将液氮中保存的斯氏副柔线虫样品迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；然后，向研钵中加入适量的RNAiso Plus，反复吹打，至均一透明；然后，将匀浆液转移至离心管中，室温15-30℃静置5min；12000g 4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中；

22)总RNA的提取：向上述匀浆裂解液中加入氯仿，RNAiso Plus的1/5体积量，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000g 4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；12000g 4℃离心10min；

23)RNA沉淀的清洗：小心弃去上清液；加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g 4℃离心5min后小心弃去上清液；

24)RNA的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀数分钟；沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；

步骤3、Pj_CPI基因RT-PCR扩增

以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPI基因并对其特有性进行验证；PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min；PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤4、PCR产物回收

按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书操作，回收Pj_CPI基因PCR产物；

步骤5、PCR回收产物与pMD19-T Simple载体的连接

取200μL离心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收产物和5μL SolutionⅠ，离心混匀，16℃过夜连接；

步骤6、重组质粒的转化

按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素Amp的固体LB培养基上，37℃培养过夜；

步骤7、重组克隆菌PCR鉴定

挑取阳性菌落，接种到含抗生素的液体LB培养基中培养过夜，以培养物做PCR扩增鉴定；

步骤8、重组克隆质粒的双酶切鉴定

按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoR Ⅰ对重组质粒进行双酶切和电泳检测；

步骤9、重组克隆菌测序

经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组克隆菌，送北京华大基因公司进行双向测序；

步骤10、目的基因与表达载体pET30a的回收

将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌株分别接种于LB培养基中培养过夜，分别提取质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoRⅠ对重组克隆质粒和pET30a质粒进行双酶切和电泳检测，胶回收目的基因片段和pET30a片段；

步骤11、目的基因与表达载体pET30a的连接

取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表达载体片段、1μL T4 DNA连接酶和1μL buffer，16℃连接过夜；构建重组表达质粒pETCPI如SEQ ID NO:2所示；

步骤12、重组表达质粒转化感受态细胞

按照北京全式金生物技术有限公司E.coli BL21感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于E.coli BL21感受态细胞中，涂布于含抗生素的固体LB培养基上37℃培养过夜；

步骤13、重组表达菌的鉴定

对构建的重组表达菌E.coli BL21，进行PCR鉴定和双酶切鉴定，经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组表达菌，送北京华大基因公司进行双向测序；具体步骤如步骤7、步骤8和步骤9所述；

步骤14、重组表达菌诱导表达条件的优化

分别对重组表达菌诱导表达时间、诱导剂IPTG浓度以及培养温度进行优化，确定最佳诱导表达条件；

步骤15、重组蛋白表达形式的检测

确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达500mL重组菌，离心收集菌体，将菌体沉淀用PBS洗3遍后，用PBS重悬沉淀，加入溶菌酶，常温放置1h，-20℃反复冻融，冰浴超声破碎15min，12000g离心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式；

步骤16、重组蛋白包涵体溶解及重组蛋白纯化

按最佳诱导条件诱导重组表达菌1L，12000g离心10min收集菌体，按上述方法裂解重组表达菌，离心收集裂解物沉淀，将沉淀用8M尿素溶解，12000g低温离心10min，收集上清液，用0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni⁺柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白；

步骤17、重组蛋白western blotting检测

将纯化出的重组Pj_CPI蛋白rCPI进行SDS-PAGE电泳，从制胶板上将蛋白质胶取出，在夹子上放置滤纸、PVDF膜、蛋白胶、滤纸，按顺序放好夹住，100V 40min转膜；转膜后取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，用现配的5％脱脂乳封闭液常温微摇封闭2h；取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，将PVDF膜在1：2000稀释的感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中4℃孵育过夜；取出PVDF膜TBST洗4min，重复3～4遍，将PVDF膜在辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼多克隆抗体中常温微摇孵育1h；取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，用ECL显色后照相。