[发明专利]提高基因编辑效率的方法和系统

说明书

本发明提供了一种提高基因编辑效率的方法和系统，具体地，本发明公开了将PEST短肽和Cas9蛋白融合后形成的融合蛋白能够显著提高基因编辑的效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及提高基因编辑效率的方法和系统。

背景技术

CRISPR/Cas9或CRISPR-Cas9系统是近年来兴起的用于基因编辑的工具。该系统由能够特异性识别DNA序列的sgRNA和能够切割DNA序列的Cas9核酸酶组成。通过Cas9对基因组上特定序列的切割，可以实现定点突变、片段删除或倒位等修饰。在加入外源供体DNA的条件下，还能够实现定点插入或替换，包括同源重组介导的精确的遗传修饰。除了对基因组进行编辑，工程化的Cas9还可以对RNA、转录水平、以及表观遗传进行调控。尽管CRISPR/Cas9技术具有简便、快速、特异等优点，但在细胞、动物、植物的应用中，其效率尚不能充分满足基因编辑，尤其是定点插入或替换的需求。提高这一系统的效率是基因编辑技术领域关注的重点。

因此，本领域技术人员致力于开发提高基因编辑效率的方法及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高基因编辑效率的方法和系统。

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白具有式Ia或Ib所述结构：

E-P (Ia)

P-E (Ib)

其中，

E为核酸内切酶蛋白元件；

P为PEST蛋白元件；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述的核酸内切酶蛋白元件选自下组：Cas9蛋白(包括SpCas9、SaCas9、NmCas9、St1Cas9)及其变体(如SpCas9的VQR、EQR、VRER等变体)、Cpf1蛋白(包括AsCpf1、FnCpf1、LbCpf1)、C2c2蛋白、Argonaute蛋白家族；TALE蛋白、锌指蛋白、dCas9等与FokI融合构成的人工核酸内切酶。

在另一优选例中，所述核酸内切酶蛋白元件为Cas9蛋白。

在另一优选例中，所述SpCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一优选例中，所述PEST蛋白元件选自下组：

ODC1蛋白的PEST序列、GCN4蛋白的PEST序列、CLN2/CLN3蛋白的PEST序列、NIMA蛋白的PEST序列、Cactus蛋白的PEST序列、HDC蛋白的PEST序列、CPEB蛋白的PEST序列、NPDC1蛋白的PEST序列、FOS蛋白的PEST序列、NFKBIA蛋白的PEST序列等。

在另一优选例中，所述PEST蛋白元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有基因编辑活性；

(C)将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留基因编辑活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白(E-P or P-E)中的肽键或肽接头的长度为0-30个氨基酸。