[发明专利]用于抗肌萎缩蛋白外显子53跳读的有效基因治疗工具

说明书

本发明涉及一种重组腺相关病毒载体(rAAV)，其包含编码反义寡核苷酸(AON)的序列，所述反义寡核苷酸针对抗肌萎缩蛋白(优选是人源的)的前信使RNA(pre‑mRNA)的外显子53的+30至+69区域的至少33个碱基片段，以及其作为药物的应用，尤其是用于治疗杜兴氏肌营养不良症(DMD)。

技术领域

本发明涉及基因治疗工具，其在治疗肌营养不良疾病，例如杜兴氏肌营养不良症(dystrophie musculaire de Duchenne,DMD)中特别有效。

这基于对反义寡核苷酸(AON)的认真选择，能够使抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的外显子53跳读(skip)，所述反义寡核苷酸由重组腺相关病毒载体(AAVr)传递，并有利地与修饰型snRNA相关联。

背景技术

杜兴氏肌营养不良症(DMD)是最常见的退行性进行性肌肉疾病。这是由X染色体携带的一种遗传性疾病，在5000名男孩中约有1名受到影响。它是由抗肌萎缩蛋白基因的突变或缺失而引起的。抗肌萎缩蛋白的不表达或异常高表达使肌纤维产生脆性，导致肌肉组织加速破坏。功能性抗肌萎缩蛋白缺陷导致纤维变性、炎症、坏死以及肌肉被脂肪组织替代，这会导致进行性肌无力并在生命的第二十至第四十年期间由于呼吸或心力衰竭而过早死亡(Moser,H.,Hum Genet,1984.66(1):17-40)。

编码抗肌萎缩蛋白的dmd基因(2.7Mb)由79个外显子组成，位于X染色体的21.2位点。抗肌萎缩蛋白是一种模块化蛋白，其具有由24个“血影蛋白样”重复结构域组成的中心区域。

抗肌萎缩蛋白基因的大多数严重突变由以下组成：一个或多个外显子缺失，破坏最终信使的阅读框；基因的一部分重复；或存在于编码区(或外显子)中的点突变，其会引入终止密码子或引起阅读相的位移。

然而，已经注意到，抗肌萎缩蛋白的截短形式，特别是不含某些重复序列的形式，是功能完整的，或至少仅具有部分缺陷，例如，被称为贝克肌营养不良症(BMD)的疾病的衰减形式。

从这一观察出发，作为提供缺陷基因完整副本的传统基因治疗(鉴于编码抗肌萎缩蛋白的基因的大小，这是有问题的)的替代方案，已经考虑了不同的策略来尝试“修复”功能失调的抗肌萎缩蛋白。

因此，外显子跳读是一种治疗方法，其由以下组成：施用反义寡核苷酸(AON)，所述反义寡核苷酸(AON)与参与待掩蔽的外显子的剪接的序列互补，以使阅读框恢复。特别地，在重复序列区域中发生的外显子跳读使得可能获得比天然蛋白更短的抗肌萎缩蛋白，但其仍然是功能性的。

在实践中，在能够恢复阅读框的所有情况中，外显子53跳读均被证明是有益的。这在理论上靶向大量可能存在于抗肌萎缩蛋白基因中的突变，特别是外显子52(Δ52)，外显子50至52(Δ50-52)，外显子49至52(Δ49-52)，外显子48至52(Δ48-52)，外显子47至52(Δ47-52)，外显子45至52(Δ45-52)，外显子43至52(Δ43-52)，外显子42-52(Δ42-52)，外显子41至52(Δ41-52)，外显子40至52(Δ40-52)，外显子39至52(Δ39-52)，外显子38至52(Δ38-52)，外显子37至52(Δ37-52)，外显子36至52(Δ36-52)，外显子35至52(Δ35-52)，外显子34至52(Δ34-52)，外显子33至52(Δ33-52)，外显子32至52(Δ32-52)，外显子31至52(Δ31-52)，外显子30至52(Δ30-52)，外显子29至52(Δ29-52)，外显子28至52(Δ28-52)，外显子27至52(Δ27-52)，外显子26至52(Δ26-52)，外显子25至52(Δ25-52)，外显子24至52(Δ24-52)，外显子23至52(Δ23-52)，外显子21至52(Δ21-52)和外显子10至52(Δ10-52)的缺失，或外显子53的重复。