[发明专利]DNA重组中的或与DNA重组相关的改进

说明书

本发明提供了一种用于构建DNA重组片段的不基于PCR的方法，所述DNA重组片段具有靶DNA的基于重组的操作所需的与所述靶DNA内的所需遗传操作位点同源的必需的侧接区，所述方法包括下述步骤：A)鉴定所述靶DNA中用于遗传元件的所需插入位点；B)对存在于待靶向用于遗传操作的DNA内所述位点上游的所选限制性内切核酸酶的内源的、本源的半位点进行定位，并由此确定上游同源区的5'范围；C)对存在于待靶向用于遗传操作的DNA内所述位点下游的同一所选限制性内切核酸酶的内源的、本源的半位点进行定位，并由此确定下游同源区的3'范围；D)合成侧接区基因盒，其引起所述上游和下游半位点的并置，从而导致形成侧接有所述上游和下游同源区的所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点；以及E)将所述侧接区基因盒插入到包含用于操作所述靶DNA的遗传元件的质粒载体中，在所述质粒载体上提供所述必需的侧接同源区，用于在所述所需插入位点处在所述靶DNA内的重组。

本发明总的来说涉及DNA重组，具体来说涉及一种用于生产DNA重组片段的方法，所述DNA重组片段具有靶DNA的基于重组的操作所需的与所述靶DNA内的所需遗传操作位点同源的必需的侧接区。因此，本发明涉及基于CrispR/Cas9、基于E/T和其他基于重组的技术，所述技术使用这些DNA片段作为它们的重组系统的组成部分。

重组的机制仍未被完全确定，但涉及DNA序列的拷贝、切割和共价连接。重组可以发生在两个不同DNA分子之间(分子间重组)或单个DNA分子的两个区域之间(分子内重组)。

本发明提供了一种将所需遗传元件插入到任何靶基因组中的方法，所述方法包括将如本文中所述形成的同源侧接的遗传元件重组到所述靶基因组中。

本发明还涉及用于病毒和基于病毒的载体的快速遗传操作的技术。所述靶DNA可以是病毒基因组，例如疱疹病毒基因组如CMV。

根据本发明的一种情况，提供了一种用于构建DNA重组片段的不基于PCR的方法，所述DNA重组片段具有靶DNA的基于重组的操作所需的与所述靶DNA内的所需遗传操作位点同源的必需的侧接区。

用于DNA病毒(疱疹病毒)基因组的操作的本发明的概述以图形示出。附图含有将本发明付诸实施的实例。

本发明的一种情况包括下述步骤：

A)鉴定所述靶DNA中用于遗传元件的所需插入位点(概述图，A)；

B)对存在于待靶向用于遗传操作的DNA内所述位点上游的所选限制性内切核酸酶的内源的(本源的)半位点进行定位，并由此确定上游同源区的5'范围(概述图，A)；

C)对存在于待靶向用于遗传操作的DNA内所述位点下游的同一所选限制性内切核酸酶的内源的(本源的)半位点进行定位，并由此确定下游同源区的3'范围(概述图，A)；

D)合成侧接区基因盒(FRC)，其引起所述上游和下游半位点的并置，从而导致形成侧接有所述上游和下游同源区的所述所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点(概述图，B)；以及

E)将所述FRC插入到包含用于操作所述靶DNA的遗传元件的质粒载体中，在所述质粒载体上提供所述必需的侧接同源区，用于在所述所需插入位点处在所述靶DNA内的重组(概述图，C和D)。

本发明的第二种情况利用了异源的(非本源的)半位点，其不存在于所述侧接靶基因组的本源DNA序列中。这种异源(非本源)的半位点的使用是本发明的这两种版本之间的唯一区别。如果用于所述靶DNA的遗传操作的重组技术不需要在所述DNA重组片段的末端处具有本源序列，则可以使用非本源的半位点。

本发明的这种修改方案包括下述步骤：

A)鉴定所述靶DNA中用于遗传元件的所需插入位点；

B)选择所选限制性内切核酸酶的异源的(非本源的)半位点，其中限制性位点的选择是基于在与待靶向的DNA区域侧接的上游和下游同源区内不存在完整形式的所述限制性位点；