[发明专利]使用单链DNA的DNA编辑

说明书

本发明公开了用于修饰细胞内DNA的组合物、方法和试剂盒以及用于修饰细胞中的基因表达的组合物和方法。具体地，本发明大体上涉及使用单链DNA编辑DNA的组合物、方法和试剂盒。还涵盖了使用人造微RNA(amiRNA)修饰基因表达的组合物和方法。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2015年6月3日提交的美国临时专利申请第62/170,306号的优先权益，其内容以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

本发明领域涉及用于修饰细胞内DNA的组合物、方法和试剂盒以及用于修饰细胞中的基因表达的组合物和方法。具体地，本发明领域涉及使用单链DNA(ssDNA)编辑DNA的组合物、方法和试剂盒。还涵盖使用人工微RNA(amiRNA)修饰基因表达的组合物和方法。

为了确保整个基因组的稳定性和活力，细胞已经发展出了复杂的机制来准确并有效地修复DNA损伤。在真核细胞中，双链断裂(DSB)的修复主要通过两个途径进行：非同源末端接合(NHEJ)和同源引导修复(HDR)。在NHEJ途径中，有数个因子用于将DSB产生的两个DNA末端再连接。在HDR途径中，使用同源DNA模板来修复DSB。

利用HDR途径已成为包括基因组编辑的DNA编辑的强有力手段。当前，有数种广泛使用的系统将诸如DSB的靶向切割引入到细胞基因组中，所述系统包括锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas系统(成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas))和Argonaute核酸酶系统。参见例如Gaj等人,Trends inBiotechnology 31(7):397-405(2013)；Gao等人,Nature Biotechnology,2016年5月2日在线发布。ZFN和TALEN通常是由连接于非特异性DNA裂解域的可编程序列特异性DNA结合序列构成的嵌合核酸酶。另一方面，CRISPR-Cas和Argonaute核酸酶系统的序列特异性来源于将Cas或Argonaute蛋白的核酸酶活性引到特定序列的引导多核苷酸(例如RNA或DNA)。通过将这些靶向核酸酶系统中的一种与修复模板DNA编码序列或与核酸酶切割位点附近的上游序列或下游序列同源的“臂”一起引入细胞中，HDR途径可用于在基因组中几乎任何位置插入感兴趣的DNA(DOI)。

修复模板DNA可以是单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。单链DNA修复模板通常长约100-200个碱基，其由数个具有改变的序列(例如点突变、重组酶识别序列、数个碱基的短缺失或插入)的碱基组成，所述碱基侧接有约40-80个碱基的同源臂。双链DNA修复模板通常需要长的同源臂，并且通常以比ssDNA修复模板低得多的效率插入。参见Singh等人,Genetics 199:1-15(2015)；Yang等人,Nat Protoc 9:1956-1968(2014)；和Ran等人,NatProtoc 8:2281-2308(2013)。当前，由于可合成的ssDNA的全长的限制和不确定是否能使用细胞的内源HDR机制将含有长DOI的ssDNA修复模板适当地并入靶序列中，所以ssDNA修复模板尚未被用于插入长DOI。插入大DOI(100个碱基)通常依赖于使用具有长同源臂的dsDNA，所述具有长同源臂的dsDNA的制作很费力且具有不良的插入效率。因此，本领域需要将大DOI(100个碱基)插入到细胞内的靶DNA序列中的更简单更有效的方法。

发明内容

本发明公开了使用单链DNA(ssDNA)编辑DNA的组合物、方法和试剂盒以及用于修饰基因表达的组合物和方法。所公开的组合物、方法和试剂盒可以用于修饰基因组DNA。