[发明专利]使用单链DNA的DNA编辑

权利要求书

1.一种用于修饰细胞中的靶DNA序列的体外方法，所述方法包含：

(a)在所述细胞中引入单链DNA(ssDNA)，所述ssDNA包含与所述靶DNA序列具有100％的序列同一性的5'同源臂、外源序列和与所述靶DNA序列具有100％的序列同一性的3'同源臂，其中所述ssDNA的长度为200至10,000个核苷酸，和

(b)在所述细胞中引入或表达核酸酶系统，其中所述核酸酶系统切割所述靶DNA序列，

其中所述外源序列的长度与所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度的比率为1.5:1至20:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源序列编码蛋白质产物、RNA产物、DNA调节元件或变体DNA序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述ssDNA通过包含如下步骤的方法产生：

(a)转录编码可操作地连接于核苷酸序列的启动子的DNA模板以产生RNA转录本，所述核苷酸序列包含与所述靶DNA序列具有100％的序列同一性的5'同源臂、外源序列和与所述靶DNA序列具有100％的序列同一性的3'同源臂，

(b)通过所述RNA转录本的逆转录来合成ssDNA/RNA双链体，和

(c)使用RNA降解酶从所述ssDNA/RNA双链体降解所述RNA，以产生ssDNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其还包含纯化所述ssDNA。

5.根据权利要求3至4任一项所述的方法，其中所述启动子包含T7启动子并且所述转录使用T7 RNA聚合酶来进行。

6.根据权利要求3至4任一项所述的方法，其中所述ssDNA/RNA双链体使用逆转录酶和引物来合成。

7.根据权利要求3至4任一项所述的方法，其中所述RNA降解酶包含RNase H。

8.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与所述靶DNA序列的不超过110个核苷酸具有100％的同一性。

9.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中在所述细胞中引入核酸酶系统包含在所述细胞中引入编码所述核酸酶系统的多核苷酸。

10.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述核酸酶系统在所述靶DNA序列处产生双链断裂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述5'同源臂与在所述双链断裂的一侧的靶DNA序列具有100％的同一性，并且所述3'同源臂与在所述双链断裂的另一侧的靶DNA序列具有100％的同一性。

12.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述核酸酶系统选自：巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute核酸酶系统和CRISPR/Cas系统。

13.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述核酸酶系统包含CRISPR/Cas系统。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas9系统。

15.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞。

16.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞是小鼠细胞。