[发明专利]用于同时检测样品中多个核酸序列的方法

权利要求书

1.一种用于检测和区分临床样品中的多个病原生物的非诊断方法，临床样品包含衍生自多个病原生物的多个不同靶RNA模板和/或多个不同靶DNA模板，每个靶DNA模板包含第一靶区段和第二靶区段，第一靶区段和第二靶区段二者的组合对于特定靶DNA模板是特异性的，其中第一靶区段和第二靶区段彼此相邻并且其中第一靶区段位于所述第二靶区段的3'，所述方法包括以下步骤：

(a)多个不同靶RNA模板逆转录为多个不同靶DNA模板的逆转录步骤和多个不同靶DNA模板的预扩增步骤；

(b)使所述多个不同靶DNA模板与多个不同探针组接触，每个探针组对于多个不同靶DNA模板中的特定靶DNA模板或其互补物是特异性的，并允许特定靶DNA模板与其杂交，每个探针组包括：

具有可与所述特定靶DNA模板的第一靶区段杂交的第一靶区域和第一标签区域的第一核酸探针，其中所述第一标签区域包含第一标签序列，以及

具有可与所述特定靶DNA模板的第二靶区段的互补物杂交的第二靶区域和第二标签区域的第二核酸探针，其中所述第二标签区域包含第二标签序列，并且其中所述第一核酸探针或所述第二核酸探针中的至少一个含有位于靶与第一或第二标签序列之间的检测序列；和

其中每个标签区域位于相应靶区域的5'；

(c)形成多个连接的探针组件，其中所述多个连接的探针组件包含多个不同探针组，并且通过将每个探针组的所述第一核酸探针与其相应的靶DNA模板链杂交和将每个探针组的所述第二核酸探针与其相应的反向靶DNA模板链杂交而形成；

(d)扩增多个连接的探针组件以获得多个扩增子，其中通过允许多个连接的探针组件与多个核酸引物对接触来扩增多个连接的探针组件，每个核酸引物对包含：

引物1和引物2，其中引物1或引物2中的至少一个在其3'端或其3'端附近包含至少一个内部供体或受体荧光标记，从而在所述多个连接的探针组件扩增后提供多个内部标记的扩增子，其中所述内部供体或受体荧光标记被并入所述第一或第二标签区域中，并且与所述检测序列相邻；和

(e)在单个反应容器中检测和区分所述多个内部标记的扩增子，其中通过进行实时解链曲线分析来检测和区分所述多个内部标记的扩增子，所述实时解链曲线分析包括：

(1)提供多个标记的检测探针，每个标记的检测探针对于特定内部标记的扩增子的特定检测序列是特异性的，并且包含：

与通过所述多个核酸引物对并入第一或第二标签区域中的内部供体或受体荧光标记互补的至少一个荧光供体或受体标记，其中使用单对供体和受体标记来检测多个内部标记的扩增子，其中每个类似标记的检测探针在与特定内部标记的扩增子的特定检测序列杂交后显示不同解链温度，使得所述多个内部标记的扩增子是可区分的；和

可与特定内部标记的扩增子的所述特定检测序列特异性杂交的核酸区域，

(2)允许所述多个内部标记的扩增子与所述多个标记的检测探针杂交，和

(3)通过测量在不同荧光检测通道内预先选择的增加的温度范围内受体标记的荧光来监测所述多个标记的检测探针的杂交和不同解链温度，其中：

所述多个标记的检测探针的杂交指示临床样品中多个不同病原生物的存在，

不同解链温度与多个标记的检测探针的不同荧光标记的组合允许检测和能够区分临床样品中的多个不同病原生物，从而可以检测和区分临床样品中的至多30种不同病原生物。

2.根据权利要求1所述的非诊断方法，其中至少步骤(b)-(e)在封闭系统中进行。

3.根据权利要求1或2所述的非诊断方法，其中步骤(a)-(e)在封闭系统中进行。

4.根据权利要求1或2所述的非诊断方法，其中进行步骤(d)以获得多个扩增子，其包含：

第一标签区域或其一部分，

第一靶区域，

第二靶区域，

检测区域，和

第二标签区域或其一部分，

或其互补物。

5.根据权利要求1或2所述的非诊断方法，其中通过扩增临床样品中的多个不同核酸获得多个不同靶DNA模板。