[发明专利]用于在采用ddNTP的方法中防止假阳性的方法和产品

权利要求书

1.一种在聚合酶的存在下抑制ddNTP与多核苷酸的结合的方法，其中所述多核苷酸为双链，但是可以任选地包括长度为至多10个核苷酸的单链区域，其中当所述单链区域提供5’突出序列时，其在紧邻双链区域不包括与所述ddNTP互补的碱基，其中所述方法(i)包括灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或(ii)使用具有一个单链区域的多核苷酸，所述单链区域提供长度为至少1个核苷酸的3'突出序列或长度为至少2个核苷酸的5'突出序列，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致，其中优选地所述方法包括熔解曲线分析。

2.如权利要求1所述的方法，其中当所述单链区域提供5’突出序列时，其在所述单链区域中任意位置均不含与所述ddNTP互补的碱基。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述ddNTP携带第一标签，并且所述多核苷酸携带第二标签。

4.如权利要求3所述的方法，其中当所述标签彼此靠近时，所述第一或第二标签影响另一标签产生的信号。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一或第二标签为荧光团，并且另一标签为在靠近所述荧光团时影响所述荧光团的荧光的分子。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述另一标签为淬灭分子。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸上的所述第二标签为荧光团。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸上的所述第二标签位于构成所述双链多核苷酸的链之一的5’端。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中当所述双链多核苷酸的一个或两个末端为平末端时，灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中当所述双链多核苷酸的一个或两个末端具有5’突出端时，灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或使用具有长度为至少2个核苷酸的单链区域(5’突出)的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸以形成5’突出链的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。

11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中当所述双链多核苷酸的一个或两个末端具有3’突出端时，灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或使用具有长度为至少1个核苷酸的单链区域(3’突出)的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸以形成3’突出链的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过在允许其杂交的条件下使第一和第二多核苷酸接触来产生所述双链多核苷酸的步骤。

13.如权利要求12所述的方法，其中在所述双链多核苷酸产生之前、期间和/或之后，进行以下步骤：灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，竞争胜过所述ddNTP，和/或使用具有长度为至少1个核苷酸(3’突出)或具有长度为至少2个核苷酸(5’突出)的单链区域的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述聚合酶用蛋白激酶K灭活或降解。

15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述聚合酶用去垢剂灭活或降解，优选用十二烷基硫酸钠。

16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述ddNTP用虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化。