[发明专利]一种猪瘟病毒（CSFV）实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

权利要求书

1.一种猪瘟猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的猪瘟病毒的靶标核酸CSFV RNA序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生CSFV靶标核酸的DNA拷贝的CSFV扩增引物T7和nT7，一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述CSFV靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的CSFV检测探针，以及可与CSFV靶标核苷酸CSFV RNA使用同一对引物即T7和nT7的竞争性内标和内标检测探针；其特征在于，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述CSFV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述CSFV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；所述CSFV内标由序列表中序列7所示的含CSFV内标RNA，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含SAT酶液，所述SAT酶液为包含M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶的混合物，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和CSFV检测探针、内标检测探针存在于一CSFV检测液中。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、CSFV反应液、CSFV检测液、SAT酶液、CSFV阳性对照、CSFV阴性对照和CSFV内标，其中：

裂解液：含硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

CSFV反应液：含dNTP和NTP；

CCSFV检测液：含T7引物、nT7引物、CSFV检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；

CSFV阳性对照；含猪瘟病毒5’-UTR的体外转录RNA稀释物；

CSFV阴性对照：不含有猪瘟病毒靶标核酸序列或不含有猪瘟病毒的溶液；

CSFV内标：含CSFV内标RNA即序列如序列表中序列7所示的稀释物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH4)2SO4 5-50mM；

(2)核酸提取液：HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针 1-50μM，磁珠 50-500mg/L；

(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(4)CSFV反应液：Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP401-10％，KCl 5-40mM；

(5)CSFV检测液：将CSFV扩增引物和CSFV检测探针溶解在TE溶液即10mM Tris和1mMEDTA的混合液中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应；

(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mMtrehalose40-200mM Tris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、体积百分浓度0.1-1％的Triton X-100和体积百分浓度20-50％的glycerol；

(7)CSFV阳性对照；含105-108拷贝/mL猪瘟病毒5’-UTR的体外转录RNA稀释物；

(8)CSFV阴性对照：不含有猪瘟病毒靶标核酸序列或不含有猪瘟病毒的溶液；

(9)CSFV内标：含105拷贝/mL CSFV内标RNA即序列如序列表中序列7所示的稀释物。