[发明专利]一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法

说明书

本发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法，首先将冻存的人类视网膜色素上皮细胞复苏并采用乙醇处理使细胞固定、破膜，然后向经固定、破膜的细胞悬液中加入Ki67抗体，混合，孵育，洗涤，最后利用流式细胞仪检测最终检测样本细胞悬液，并参照非特异性同型得到特异性蛋白阳性表达细胞的比例。本发明中的检测方法适用于冻存后染色体色素上皮细胞增殖能力的检测，应用范围广，步骤简单易于操作，检测过程耗时短，准确度高。

技术领域

本发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法，属于细胞检测技术领域。

背景技术

视网膜色素上皮细胞是眼球中重要的一种细胞，具有顺反视黄醛转化、支持视细胞、视网膜物质交换等功能，在某些情况下，视网膜色素上皮细胞的状态直接关系到患者视力功能的健全与否。

针对人类视网膜色素色素上皮细胞活性的检测，目前尚未有明确方法，但仍可以借鉴其他细胞检测方法，例如：MTT比色法，流式细胞术法等，其中流式细胞术法优于具有快速、稳定性高的优点，因此得到越来越广泛的关注。

相关技术中，流式细胞术检测细胞活性的常用手段包括：BrDU检测法：将一定浓度的BrDU孵育细胞；经固定变性（酸解、热解、酶解）后与抗体结合染色，镜检或流式细胞术鉴定。或者是EDU检测法：采用一定浓度的EdU孵育细胞；固定后染色，镜检鉴定。

目前常规的增殖能力检测方法的不足分别为：BrDU检测法的孵育时间长，DNA需经变性才能与抗体结合，操作复杂，不能直接用于冻存细胞的鉴定。EdU检测法不能直接用于冻存细胞的鉴定。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前细胞增殖能力检测时操作复杂、孵育时间长且不能检测冻存细胞的问题，提供了一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法。

本发明采用如下技术方案：一种人类视网膜色素上皮细胞增值能力的检测方法，包括如下步骤：

（1）将冻存的人类视网膜色素上皮细胞置于37-38℃水浴锅中复苏1-1.5min，加入9-10倍体积的1×PBS洗涤，离心去上清；

（2）将复苏后的人类视网膜色素上皮细胞加入5-6ml乙醇进行重悬细胞处理，然后将人类视网膜色素上皮细胞在-20--25℃温度下固定破膜处理2-24h，然后采用细胞滤筛过滤成单个细胞，离心去上清，得到经固定、破膜的细胞悬液；

（3）加入staining buffer 进行重悬细胞，离心弃上清，并重复一次；

（4）向经固定、破膜的细胞悬液中按5ul/1×106个细胞加入Ki67抗体，混合，常温避光孵育，洗涤，得到最终检测样本细胞悬液；

（5）利用流式细胞仪检测最终检测样本细胞悬液中ki67阳性细胞比例，并以与6ul/1×106个细胞非特异性抗体共孵育处理的人类视网膜色素上皮细胞作为非特异性同型，对照得到特异性蛋白阳性表达细胞的比例；

（6）检测得到的ki67阳性细胞比例即为处于增殖周期内人类视网膜色素上皮细胞比例。

进一步的，所述步骤（4）中流式细胞仪的检测时间为2~4h。

进一步的，所述步骤（2）中采用浓度为75-80%的乙醇溶液。

进一步的，所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中离心去上清时离心机的离心力为400-420g，离心时间为5-8min。

进一步的，所述步骤（5）中的非特异性抗体为Isotype control抗体。