[发明专利]一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法有效
| 申请号： | 201611258465.2 | 申请日： | 2016-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN106769803B | 公开（公告）日： | 2019-07-02 |
| 发明（设计）人： | 胡轶倩;范国平;陆梦华;李宁;方攀峰 | 申请（专利权）人： | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 |
| 主分类号： | G01N15/10 | 分类号： | G01N15/10 |
| 代理公司： | 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104 | 代理人： | 曹祖良;任月娜 |
| 地址： | 214028 江苏省无锡市新*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 视网膜色素上皮细胞 增殖能力 冻存 破膜 色素上皮细胞 阳性表达细胞 流式细胞仪 特异性蛋白 应用范围广 非特异性 细胞固定 细胞悬液 样本细胞 乙醇处理 准确度 染色体 孵育 抗体 悬液 洗涤 耗时 复苏 | ||
1.一种人类视网膜色素上皮细胞增值能力的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将冻存的人类视网膜色素上皮细胞迅速置于37-38℃水浴锅中复苏1-1.5min，融化后加入9-10倍体积的1×PBS洗涤，离心去上清；
（2）将复苏后的人类视网膜色素上皮细胞加入5-6ml乙醇进行重悬细胞处理，然后将人类视网膜色素上皮细胞在-20--25℃温度下固定破膜处理2-24h，然后采用细胞滤筛过滤成单个细胞，离心去上清，得到经固定、破膜的细胞悬液；
（3）加入staining buffer 进行重悬细胞，离心弃上清，并重复一次；
（4）向经固定、破膜的细胞悬液中按5ul/1×106个细胞加入Ki67抗体，混合，常温避光孵育，洗涤，得到最终检测样本细胞悬液，流式细胞仪的检测时间为2~4h；
（5）利用流式细胞仪检测最终检测样本细胞悬液中ki67阳性细胞比例，并以与6ul/1×106个细胞非特异性抗体共孵育处理的人类视网膜色素上皮细胞作为非特异性同型，对照得到特异性蛋白阳性表达细胞的比例；
（6）检测得到的ki67阳性细胞比例即为处于增殖周期内人类视网膜色素上皮细胞比例。
2.如权利要求1所述的人类视网膜色素上皮细胞增值能力的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中采用浓度为75-80%的乙醇溶液。
3.如权利要求1所述的人类视网膜色素上皮细胞增值能力的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中离心去上清时离心机的离心力为400-420g，离心时间为5-8min。
4.如权利要求1所述的人类视网膜色素上皮细胞增值能力的检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中的非特异性抗体为Isotype control抗体。
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