[发明专利]生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及生产L‑亮氨酸菌株和生产L‑亮氨酸的方法。本发明以紫外线和亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌进行诱变，获得了两个有利于L‑亮氨酸产生的关键突变leuA^G561D和ilvB^G235S，研究表明，leuA^G561D和/或ilvB^G235S突变条件下，L‑亮氨酸的合成途径中的反馈抑制被解除，L‑亮氨酸的产量得到大幅提高，获得了能够大量产生L‑亮氨酸的菌株，保藏编号为CGMCC NO.13408，该菌株能够实现发酵过程中L‑亮氨酸的高效积累，L‑亮氨酸可达4.7g/L。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法。

背景技术

L-亮氨酸即α-氨基-γ-甲基戊酸或α-氨基异己酸，属于支链氨基酸，是人体必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸是亮氨酸的左旋体，在医药、食品、化妆品、及饲料等行业中具有非常广泛的应用。

在L-亮氨酸的生产中常用提取法、化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法以其环保、条件温和、质量稳定等优点成为L-亮氨酸生产的主要方法。在L-亮氨酸生产行业中日本企业占主导地位，尤其是日本味之素公司，其在亮氨酸生产中具有非常明显的优势。

目前，随着生物学的不断发展进步，L-亮氨酸在棒杆菌属中的生物合成途径及其调控机制已掌握清楚。谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13869基因组测序的完成及谷氨酸棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过基因工程手段对谷氨酸棒杆菌进行改造成为现实。研究表明，在L-亮氨酸的合成途径中，存在多个关键酶，其中，leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，催化α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸，是L-亮氨酸合成途径的关键酶，受终产物L-亮氨酸的反馈抑制。ilvBN编码乙酰羟酸合酶，受L-亮氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制，其中ilvB编码乙酰羟酸合酶的大亚基，起催化作用。解除反馈抑制有助于提高L-亮氨酸等支链氨基酸的产量。现有的亮氨酸生物合成菌株和方法已经逐渐不能满足日益加大的市场需求，因此，利用生物工程方法，进一步开发能够大量生成亮氨酸的菌株和生产方法成为了研究的热点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法，本发明提供的菌株产亮氨酸的量可达4.7g/L。

本发明提供了突变的leuA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了编码突变的leuA蛋白的DNA分子。

编码突变的leuA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了突变的ilvB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供了编码突变的ilvB蛋白的DNA分子。

编码突变的ilvB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述突变是指遗传物质发生改变，其可为点突变或片段突变。具体为氨基酸或碱基的添加、缺失或替换。其为紫外诱变后以亚硝基胍诱变获得。紫外诱变的条件为紫外15W，30cm，20分钟；亚硝基胍诱变的条件为0.5mg/mL，33℃，30分钟；诱变后，筛选对4-氮杂亮氨酸最具有抗性的突变菌株。培养基中，4-氮杂亮氨酸的浓度为1g/L。