[发明专利]一种制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备技术，尤其是涉及一种可获取大量鼠源性单克隆抗体的小鼠模型建立方法。

背景技术

1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术，将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞的小鼠脾细胞融合，形成的杂交瘤细胞既能产生抗体又能进行分裂繁殖，且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇，称为单克隆抗体。目前单克隆抗体主要应用于疾病的预防、诊断和治疗，生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究中。治疗性单抗（单克隆抗体）的市场在新药开发中有逐年增长的趋势，1997年单抗的销售额是50亿美金，以后每年都有40%到50%的增长，至2003年已达到1997年的十倍，达500亿美金，由此可见单抗技术是生物技术领域中升起的一颗新星。

随着对单克隆抗体药物研究的不断深入以及新药的不断推出，单克隆抗体药一直处于较高的增长率。单克隆抗体不仅在体外诊断试剂上得以广泛应用，还可直接用于对人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔的前景。

我国的单克隆抗体药物从无到有发展迅速，已在我国医药市场发挥着越来越重要的作用，但是单克隆抗体在我国市场仍属高端产品，主要依赖进口。

目前在国内外实验室广泛采用的制备单抗的方法主要有两大系统，一是体外培养法；二是动物体内生产法。

杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞（anchorage dependent cell，ADC），因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。目前杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的体外培养手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含20%小牛血清的培养基培养，细胞浓度以1×10⁶-2×10⁶/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。显然，这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。因为单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。目前对于杂交瘤细胞的大量培养方法包括以下几种：

1、悬浮培养法：即小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器，美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产这类反应器，其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。

2、微载体培养法：微载体（Microcarrier）是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下微载体悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。可用作细胞大量培养的微载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品，其中以Cytodex I，Biosilon和Superbeads为好。

3、中空纤维细胞培养系统：该系统由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成。尽管该培养系统在大规模生产单抗时成本较低，并可获得高产量高纯度的抗体，但是由于设备价格昂贵，限制了其使用范围。

4、微囊化细胞培养系统：该系统是先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。

5、杂交瘤细胞的无血清培养：杂交瘤细胞的体外培养绝大多数应用DMEM或RPMI-1640为基础培养基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清。由于血清中含有上百种的蛋白质，这给单抗的纯化带来很大麻烦，而未纯化的含有异种蛋白的单抗用于动物治疗可诱发变态反应。无血清培养的实质就是用各种不同的添加剂来代替血清，然后进行杂交瘤细胞的培养。采用无血清培养基培养杂交瘤细胞制备单抗，有利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；同时无血清培养基还缺少血清中保护细胞免受环境中蛋白酶损伤的抑制因子等。

虽然以上体外培养生产单抗的方法随着技术的不断发展会趋于更加完善，但依然无法代替从动物体内获取单克隆抗体。