[发明专利]生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用，生产肉桂醇的重组大肠杆菌构建方法包括如下步骤：向大肠杆菌中引入苯丙氨酸解氨酶PAL，对羟基肉桂酸辅酶A连接酶4CL，肉桂酰辅酶A还原酶CCR，得到一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌。大肠杆菌作为模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养，成本低廉；且本发明通过构建肉桂醇合成通路，得到生产络塞苷元肉桂醇的大肠杆菌，肉桂醇产量达到300mg/L；进一步引入UDP葡萄糖基转移酶，将络塞与肉桂醇的生物合成途径有机地结合在一起，络塞的产量最高可达280mg/L。本发明为肉桂醇和/或络塞的大规模工业生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用。

背景技术

红景天是一种传统草药，具有抗衰老，抗疲劳，增强免疫功能，保护心脑血管和抗肿瘤的生理活性。红景天作为一种环境适应性新兴植物药，自20世纪60年代以来，科学家对其化学活性成分及药理作用等进行了广泛研究。分析发现其主要活性成分包括红景天苷、络塞及其衍生物络塞维和络塞琳。络塞及其衍生物络塞维和络塞琳具有抗氧化，提高身体耐力，缓解心理压力和增强记忆等药理活性。其苷元肉桂醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，可用于香精香料原材料及药物合成中间体。

络塞具有以下特征：英文名称rosin，化学名称为(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hydroxymethyl)-6-[(E)-3-phenylprop-2-enoxy]oxane-3,4,5-triol或Trans-cinnamylO-β-D-glucopyranoside，分子式C15H20O6，分子量为296.32，CAS号为85026-55-7，结构式为

肉桂醇有以下特征：英文名称Cinnamic alcohol，化学名称为3-Phenyl-2-propene-1-ol，分子式为C9H10O，分子量为134.18，CAS号为104-54-1，结构式为

目前，络塞主要来源是植物提取。红景天野生资源过度开采，造成红景天日益匮乏，生态环境面临严重威胁，许多国家已将红景天列为濒危物种。络塞及其衍生物络塞维和络塞琳仅存在于少数红景天种类，如高山红景天(Rhdiola sachalinnsis)、喜马拉雅红景天(Rhodiola himalensis)、玫瑰红景天(Rhodiola rosea)和齿叶红景天(Rhodiolaserrata)等，其含量只有0.1％-3％。除植物提取外，也可通过生物转化获得络塞。

Furmanowa等采用玫瑰红景天愈伤组织培养，在悬浮细胞培养物中添加肉桂醇，获得了络塞及其衍生物络塞维(Furmanowa M,Oledzka H,Michalska M,Sokolnicka I,Radomska D(1995)Rhodiola rosea L.(Roseroot):in vitro regeneration and thebiological activity of roots.In:Bajaj YPS(ed)Biotechnology in agriculture andforestry,vol 33.Medicinal and Aromatic Plants VIII(pp 412–426).Springer,Berlin)。

Grech-Baran等采用发根培养方法，在培养基中添加肉桂醇，通过生物转化获得络塞及其衍生物络塞维(Grech-Baran M,-Baranek K,Krajewska-Patan A,A,Pietrosiuk A(2014)Biotransformation of cinnamyl alcohol to rosavinsby non-transformed wild type and hairy root cultures ofRhodiolakirilowii.Biotechnol Lett 36:649–656)。

络塞的异源生物合成还没有相关报道。因此构建络塞的异源合成通路，实现重组大肠杆菌利用葡萄糖发酵生产肉桂醇和/或络塞具有重要的科研价值和社会效益。