[发明专利]一种运载质粒及其构建及其使用方法

说明书

本发明公开了一种关于鱼腥藻7120三亲转化系统中运载质粒的构建及其使用方法，通过序列与连接不依赖的克隆(SLIC)方法一步将核酸元件重组形成质粒pPT27。连接目的核酸序列后生成运载质粒，同帮助和结合质粒一起将外源DNA序列转移至宿主细胞内，通过标记基因筛选到目的突变株。本发明还公开了pPT27质粒的使用方法，转入绿色荧光蛋白(GFP)和一种融合蛋白(FdnifK)。本发明构建所得的运载载体(pPT27)可以用于目的DNA片段的功能分析和蛋白表达，应用所构建的质粒可以快速、高效、省时的构建运载质粒并且可以避免DNA序列的限制，在基因功能研究方面有着重要的意义。

技术领域

本本发明公开了一种关于鱼腥藻7120三亲转化系统中运载质粒的构建及其使用方法，属于基因工程中的克隆技术领域。

背景技术

在鱼腥藻7120中，重要的基因无法获得其突变株，所以基因的过表达株的生理表型可以反映未知基因的功能。得到过表达株可以使用Wolk的三亲转化方法(Wolk et al.,Construction of shuttle vectors capable of conjugative transfer fromEscherichia coli to nitrogen-fixing filamentous cyanobacteria，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1984；Javier et al.Role of a Microcin-C-likebiosynthetic gene cluster in allelopathic interactions in marineSynechococcus，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2013；Jeff et al.Reduction of conjugaltransfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp.strain PCC7120，J.Bacteriol.，1997)。三亲转化方法是在结合质粒的作用下由帮助质粒将运载质粒线性化后转入宿主中，这一方法具有易操作、转化成功率高等优点。对于外源基因转移至其基因组上，关键是在运载质粒的体外重组构建，是一个必不可少的操作步骤，是限速步骤之一。在传统的构建运载质粒实际操作过程中，需要使用另外的质粒例如pUC19先构建好重组序列后，再将序列转至运载质粒上(例如Wolk方法中使用的pRL271质粒)。而且，常用的Geteway和Cre-loxP重组策略是需要特殊的重组位点。因此，一种更直接、更有效率的转化系统及运载质粒是更理想和迫切需要的。

发明内容

构建本发明的通用的运载质粒(本文称为pPT27)有助于简单快速构建重组质粒，为进一步对未知基因的功能进行研究提供便捷有力的遗传工具(即过量表达内源或者异源DNA序列)。相比较于现有技术已知的运载质粒例如Wolk方法中使用的pRL271质粒，本发明构建的pPT27质粒可以直接将目的片段通过PCR扩增纯化后连接，继而通过SLIC的方法获得目的运载质粒，省去了中间所需的大量实验和时间，而且这一方法不需要特异重组位点，不会导入基因组额外的序列和不存在序列上的限制。

本发明的目的在于提供通用的过表达质粒pPT27及其使用方法。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种鱼腥藻7120三亲转化系统的运载质粒，其核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示。

本发明还提供一种如权利要求1所述的运载质粒的构建方法，包括下述步骤：

A.使用限制性内切酶XhoI酶切含有蔗糖致死基因的载体质粒pRL271(SEQ ID No:1)，使其线性化并回收片段；

B.从鱼腥藻7120基因组DNA扩增同源重组双交换上游片段(SEQ ID No:3)、下游片段(SEQ ID No:4)和诱导型启动子P(SEQ ID No:5)，从质粒kan-pUC19中扩增筛选抗性基因kan(SEQ ID No:6)；