[发明专利]一种运载质粒及其构建及其使用方法

权利要求书

1.一种用于鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)三亲转化系统的运载质粒pPT27，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

2.如权利要求1所述的运载质粒的构建方法，包括下述步骤：

A.使用限制性内切酶XhoI酶切载体质粒pRL271，使其线性化并回收片段；

B.从鱼腥藻7120基因组DNA扩增同源重组双交换上游片段、下游片段和诱导型启动子P，从质粒kan-pUC19中扩增筛选抗性基因kan；

C.将步骤B获得的同源重组双交换片段上游片段、下游片段、诱导型启动子P和筛选抗性基因kan及线性pRL271连接获得pPT27质粒(SEQ ID No:2)；

步骤A中，所述载体质粒pRL271的序列如SEQ ID No:1所示；并且在步骤B中，所述同源重组双交换上游片段的序列如SEQ ID No:3所示，所述下游片段的序列如SEQ ID No:4所示，所述诱导型启动子P的序列如SEQ ID No:5所示，所述筛选抗性基因kan的序列如SEQ IDNo:6所示。

3.根据权利要求2所述的构建方法，还包括步骤D.将步骤C获得的pPT27质粒转化到大肠杆菌中，从阳性克隆中提取pPT27质粒。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于在步骤B中，所述诱导型启动子是铜离子诱导型的并且在铜离子存在环境下转录其后的开放性读码框。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤B中用于扩增同源重组双交换上游片段的引物序列为

上游引物：CAGAAATTCGATATCTAGATCTCGAGTCTTCCTGTAAACGGTATGG(SEQ ID No:9)；和

下游引物：TGAGTGCTTGCGGCAGCGTGAGGTACTCTAATACTGTAAGATATAG(SEQ ID No:10)；

用于扩增同源重组双交换下游片段的引物序列为：

上游引物：CAGGTTAGGAGAACGCCGTCGACTCTAGACTTGAAATCATTAAAATATTGG(SEQ ID No:11)；和

下游引物：GGCGGACGGGAAGTATCCAGCTCGAGGTATGAGACTTATGACAAACCC(SEQ ID No:12)。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤B中用于扩增诱导型启动子P的引物序列为：

上游引物：CATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCGGGGATCCCAGTACTCAGAATTTTTTGCT(SEQ ID No:13)；和

下游引物：GTCGACGGCGTTCTCCTAACCTG(SEQ ID No:14)。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤B中用于扩增筛选抗性基因kan的引物序列为：

上游引物：CCTCACGCTGCCGCAAGCACTCA(SEQ ID No:15)；和

下游引物：CCGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATG(SEQ ID No:16)。

8.如权利要求1所述的运载质粒的使用方法，包括以下步骤：

A.使用PCR扩增将pPT27质粒线性化；

B.将目的片段连接至线性化的pPT27质粒中而获得目的运载质粒；

C.将步骤B获得的质粒转化至大肠杆菌中，筛选正确的克隆子；

步骤A中用于将pPT27质粒线性化的引物序列为：上游引物：

TCTAGACTTGAAATCATTAAAATATTGG(SEQ ID No:17)；和下游引物：

GTCGACGGCGTTCTCCTAACCTGTAG(SEQ ID No:18)。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于所述步骤B中所述目的片段为GFP基因片段或融合基因片段FdnifK；所述GFP基因片段的序列如SEQ ID No:7所示，所述融合基因片段FdnifK如SEQ ID No:8所示。