[发明专利]一种从链霉菌发酵液中分离纯化酮还原酶的方法

说明书

本发明提供了一种从链霉菌发酵液中分离纯化酮还原酶的方法。本发明还提供了从发酵液中分离提取酮还原酶的工艺流程。本发明整个操作流程中，能够较快的得到高纯度产物。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其是生物活性物质分离纯化领域。具体而言，本申请涉及发酵液中酮还原酶的分离纯化方法。

背景技术

手性芳香醇是高科技、高附加值产品。光学活性的芳香醇在药物工业有重要的应用，它们可分别作为合成(R)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等多种治疗神经系统、心血管等疾病的手性药物的重要中间体。传统的制备法从消旋的芳香醇经多级拆分，不仅步骤繁琐，且浪费试剂。而利用酮还原酶直接通过芳香酮的不对称氢转移氢化，一步合成单一对映体的芳香醇，不仅简化了生产步骤，而且节省成本，具有很大的经济效益。

本发明所涉及的酮转移酶，就可以催化芳香酮的不对称氢转移氢化反应，生成手性芳香醇，为手性药物的生物合成提供新的方法。

发明内容

本发明提供了一种从发酵液中分离纯化酮还原酶的方法。该方法具有工艺简单、品质稳定、产品收率高等优点。本发明的技术方案如下：

(1)发酵液预处理：将链霉菌发酵液离心收集菌体，用含有KCl的Tris HCl缓冲液洗涤两遍，再用缓冲液悬浮菌体，备用；

(2)菌体悬浮液处理：将步骤(1)中处理后的菌体悬浮液均质机匀浆，获得细胞破碎液；

(3)离心：将步骤(2)的细胞破碎液离心，收集上清液，获得粗酶液；

(4)DEAE柱层析：将步骤(3)中获得的粗酶液经DEAE纤维素柱层析，并用KCl缓冲液梯度洗脱，紫外检测并收集洗脱液；

(5)DEAE柱层析：将步骤(4)中洗脱液经DEAE-Sephecal柱层析，并用KCl缓冲液梯度洗脱，紫外检测并收集洗脱液；

(6)凝胶过滤：将步骤(5)中收集到的洗脱液过Sephadex G100柱，3倍柱床体积缓冲液，紫外检测并收集洗脱液；

(7)凝胶过滤：将步骤(6)中收集到的洗脱液过Sephacry S200柱，3倍柱床体积缓冲液，紫外检测并收集洗脱液；

(8)冷冻干燥：将步骤(7)中收集到的洗脱液添加酶保护剂，混合均匀后冷冻干燥，获得高纯度酶干粉；

优选步骤(1)中缓冲液的浓度为0.025mol/L。

优选步骤(2)中均质机的压力为60-80Mpa，均质时间为1-3min；

优选步骤(3)中离心转速为6000rpm，时间为5min；

优选步骤(4)、(5)、(6)、(7)中的缓冲液为0.025mol/L Tris HCl，流速为3-5BV/h；

优选步骤(4)中KCl的梯度范围为0.2-0.5mol/L；

优选步骤(5)中KCl的梯度范围为0.2-0.35mol/L，洗脱酶蛋白的范围为0.22-0.24mol/L；

优选步骤(8)中酶保护剂为15％的甘油+5％乙二醇，添加量为0.5-1倍体积。

附图说明

无。

具体实施方式

以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

(1)发酵液预处理：将链霉菌发酵液离心收集菌体，用含有0.025mol/L KCl的0.025mol/L Tris HCl缓冲液洗涤两遍，再用缓冲液悬浮菌体，备用；