[发明专利]炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法与应用在审
| 申请号： | 201611170324.5 | 申请日： | 2016-12-16 |
| 公开（公告）号： | CN106596975A | 公开（公告）日： | 2017-04-26 |
| 发明（设计）人： | 张华莉;黄莉;王莉;罗卉;李懿莎;左晓霞;朱红林;王国春;刘瑛;贺维佳;刘可;刘梅冬;陈广文;肖献忠 | 申请（专利权）人： | 中南大学 |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68;C12N15/85;C12N9/04 |
| 代理公司： | 长沙星耀专利事务所43205 | 代理人： | 姜芳蕊 |
| 地址： | 410083*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 炎症 性肌病 hmgcr 自身抗体 放射性 检测 方法 应用 | ||
1.炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法，其特征在于，包括：炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法和免疫印迹检测方法。
2.根据权利要求1所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法，其特征在于，所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法，包括以下步骤：
(1)利用引物HMGCR-F和HMGCR-R从pENTER-HMGCR质粒中扩增人HMGCR的C末端；
(2)回收纯化PCR片段克隆至pCMV-myc载体，构建带有Myc标签的含HMGCR C末端的质粒pCMV-myc-HMGCRC，酶切鉴定确定质粒pCMV-myc-HMGCRC中含HMGCR的C末端；
(3)测序证实HMGCR C末端序列和读码框的准确性；
(4)将pCMV-myc-HMGCRC质粒瞬时转染人胚肾HEK293细胞48小时，通过Western Blot法用c-myc抗体或HMGCR抗体确定HMGCR C末端在HEK293细胞中的过表达；
(5)采用20ul HMGCR抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清与200ug过表达HMGCR C端的细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，用c-myc抗体进行检测。
3.根据权利要求2所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法，其特征在于，所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法步骤(1)中所述的引物HMGCR-F的序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物HMGCR-R的序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求2所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法，其特征在于，所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法包括：用Protein G磁珠分别与20ul HMGCR抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清进行结合，继而与过表达HMGCR C端的细胞裂解液孵育进行抗原吸附，洗脱后进行SDS-PAGE凝胶电泳，用c-myc抗体进行检测。
5.根据权利要求1所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法，其特征在于，所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：
1)将带有Myc标签的pCMV-myc-HMGCRC质粒瞬时转染人胚肾HEK293细胞48小时，通过Western Blot法用c-myc抗体检测所述pCMV-myc-HMGCRC质粒在HEK293细胞中的过表达；
2)将20ug过表达HMGCR C端的HEK293细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳，用HMGCR抗体阳性血清作为一抗，用兔抗人IgGH&L作为二抗进行检测。
6.根据权利要求5所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法，其特征在于，所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的免疫印迹检测方法包括：将过表达HMGCR C端的HEK293细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳，用HMGCR抗体阳性的患者血清作为一抗，用兔抗人IgG H&L作为二抗进行检测。
7.根据权利要求1-6任一项所述的炎症性肌病HMGCR自身抗体的非放射性检测方法的应用，其特征在于，用于检测特发性炎症性肌病患者的抗HMGCR自身抗体。
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