[发明专利]一种证明NO与缝隙连接关系的实验方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种证明NO与缝隙连接关系的实验方法，具体地说，是探讨NO是否通过调节SHR外周血T淋巴细胞缝隙连接的表达调控炎症分子的释放来保护靶器官。

背景技术

炎症因子的表达调控是炎症反应的关键步骤，与自身免疫疾病以及癌症等密切相关.一氧化氮(nitricoxide，NO)在炎症因子表达调控中具有重要作用，但已有的研究多关注于NO合成对炎症因子的调控作用，而关于NO是否通过调节SHR外周血T淋巴细胞缝隙连接的表达调控炎症分子的释放来保护靶器官未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种证明NO与缝隙连接关系的实验方法。

其具体技术方案为：

一种证明NO与缝隙连接关系的实验方法，包括以下步骤：

步骤1、尾动脉血压监测使用全自动大小鼠无创血压测量仪检测WKY大鼠、SHR和NO干预组三组大鼠尾动脉血压。测量时先预热，将血压计的充气尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安静后，重复测量血压3次，结果取其平均值。

步骤2、HE染色10％水合氯醛麻醉，取脑基底动脉，置入福尔马林溶液固定48h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋，待制作切片(厚度3um)，然后进行HE染色，光学显微镜下观察脑血管基本结构和病理学改变。

步骤3、流式细胞术检测大鼠外周血T淋巴细胞亚群及CD4+和CD8+上Cx40的表达

①大鼠外周血淋巴细胞悬液制备

10％水合氯醛麻醉，采集腹主动脉血液3ml，离心，去上清，加入等体积PBS溶液，充分混匀，轻铺于等量淋巴细胞分离液上，离心，抽取中间白膜层部分，离心，弃上清，PBS溶液重悬，备用。

②外周血T淋巴细胞亚群和Cx40的检测

取3只流式染色管分别标记为空白管、同型对照管和测定管，各管分别加入50μL淋巴细胞悬液，测定管加入按照说明书要求不同剂量的CD3+、CD4+、CD8+、CD25+荧光抗体，空白对照管不加任何抗体，同型对照管加入相同荧光标记的同型抗体，充分混匀后室温避光孵育15min，PBS溶液重悬，上机。标记CD4+和CD8+的荧光抗体管中加入固定剂120μL，4℃孵育30min，加入破膜剂，根据说明书参考浓度加入山羊抗大鼠Cx40抗体、FITC标记的山羊抗小鼠IgG和FITC同型对照，37℃孵育30min，PBS溶液重悬，上机，上机使用CELLQuest软件进行检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

与WKY大鼠相比，SHR尾动脉血压升高；脑基底动脉内皮严重受损，平滑肌层有明显的炎性细胞浸润；外周血中CD4+CD25+和CD8+表达频率降低，CD4+、CD4+和CD8+上的Cx40的表达比率升高。SHR+NO组与SHR相比，尾动脉血压明显降低；脑基底动脉内皮受损程度及炎性细胞浸润程度减轻；外周血中CD4+CD25+和CD8+表达频率升高，CD4+及CD4+和CD8+上Cx40的表达比率降低。结论SHR脑血管内皮受损且有炎性细胞浸润，伴随外周血T淋巴细胞亚群紊乱及T淋巴细胞上Cx40表达增加，经NO干预后，脑血管内皮受损程度及炎性细胞浸润程度减轻，外周血T淋巴细胞亚群紊乱状态得到纠正，且T淋巴细胞上Cx40表达降低，由此推断NO可能通过抑制SHR外周血T淋巴细胞间缝隙连接来保护脑血管。

附图说明

图1是本发明证明NO与缝隙连接关系的实验方法的流程图；

图2是脑基底动脉HE染色，×400；

图3是三组大鼠外周血CD4⁺表达频率，其中，**P<0.01,vs WKY大鼠；##P<0.01,vs SHR；

图4是三组大鼠外周血CD8⁺表达频率，其中，**P<0.01,vs WKY大鼠；##P<0.01,vs SHR；

图5是三组大鼠外周血CD4⁺CD25⁺表达频率，其中，***P<0.05,vs WKY大鼠；##P<0.01,vs SHR；

图6是三组大鼠外周血CD4⁺Cx40表达频率，其中，*P<0.0001,vs WKY大鼠；##P<0.01,vs SHR；

图7是三组大鼠外周血CD8⁺Cx40表达频率，其中，**P<0.01,vs WKY大鼠；##P<0.01,vs SHR。