[发明专利]一种基于16SrDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法

权利要求书

1.一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于至少包括以下步骤：

(1)于榨菜盐渍池中取样，样品置于无菌冷冻管中，立即放入液氮中保存，然后置于超低温冰箱中，

(2)提取样品DNA并做琼脂糖凝胶电泳检测后做PCR，扩增16S rDNA，所述的PCR扩增的特异性引物的上游引物515F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，特异性引物的下游引物907R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，PCR扩增区域为微生物16S rDNA的V4-V5可变区域，测序前需对所述PCR产物进行回收纯化，

(3)将步骤(2)获得的PCR产物进行高通量测序并做比对分析，确定优势菌群种类与组成比例，

(4)优势菌株的定向筛选，

(5)定向筛选菌株的高密度增殖培养，

(6)离心并冷冻干燥，

将步骤(5)经高密度增值培养的菌液加入脱脂奶粉，摇匀后离心，去除上清培养液，收集试管底部菌体；收集的菌体加入冻干保护剂后做冷冻干燥，其中：菌体与冻干保护剂质量分数配比为1:3-1:2.5，

(7)将步骤(6)得到的各定向筛选和高密度增值培养的菌株冷冻干燥粉按照16S rDNA测序确定的优势菌群种类与组成比例混合，制得榨菜专用直投式发酵剂。

2.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中取样采用3点取样法，采集点分别位于盐渍池中心、盐渍池对角线两点，每处采集3次样品，采集后混匀。

3.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)优势菌株的定向筛选按如下操作：在所述步骤(1)的所取样品中，取1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在定向培养基上，然后在35～37℃恒温箱中定向培养36～72h，观察菌落；然后将定向培养的菌株进行生理生化特征鉴定实验；根据鉴定结果，将定向筛选后的菌株进行斜面培养。

4.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)定向筛选菌株的高密度增殖培养按如下步骤操作：将上述步骤(4)定向筛选与纯化培养的菌株进行高密度增值培养，高密度增值培养基为MRS琼脂培养基，培养条件为35～37℃恒温箱中培养48～72h；所述的MRS琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐温80 1.0毫升、磷酸氢二钾2.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸三胺2.0克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05克、琼脂粉15.0克和蒸馏水1升，加热溶解后，校正pH＝6.2～7.2，121℃高压灭菌15～20分钟。

5.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中将步骤(5)经高密度增值培养的菌液，加入2.7～3.5％经高温灭菌的脱脂奶粉，摇匀后以4000-5000rpm转速于-5～10℃条件下离心25-30分钟。

6.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中冻干保护剂配方为：脱脂乳25-30克、乳糖10-15克、葡糖糖5-12克、维生素C5-6.5克、D-山梨醇5-7.2克、L-谷氨酸5-6克和蒸馏水250mL；冻干保护剂加热溶解后，121℃高压灭菌15-20分钟后备用。

7.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中冷冻干燥的主要工艺参数为：-50～-70℃预冻12-24h后，-60～80℃冻干24-72h。