[发明专利]一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备及其应用，含以下步骤：将含有石斑鱼神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的重组载体pET32a‑NNV转化到大肠杆菌BL21，诱导融合基因进行表达；将表达后的NNV衣壳蛋白包涵体进行纯化；将纯化后的NNV衣壳蛋白添加到黄粉虫饲料中，将虫体培养至特定阶段，冷冻干燥并碾磨成粉末；用虫体粉末喂食石斑鱼，使石斑鱼免疫神经坏死病毒。本发明提供的方法可以使用大肠杆菌大量表达NNV衣壳蛋白；食用了NNV衣壳蛋白的黄粉虫体粉能有效提高石斑鱼对神经坏死病的免疫力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法。

背景技术

石斑鱼是一种重要的经济鱼类，尤其是在亚洲。神经坏死病毒(NNV)可攻击石斑鱼的神经系统，造成致命性的病毒脑病和视网膜病变。NNV一旦爆发会造成仔、稚鱼的大量死亡，发病后死亡率高达80-100％，带来巨大的经济损失，成为限制石斑鱼养殖业发展的主要瓶颈。

石斑鱼神经坏死病毒(NNV)属于Betanodaviridae病毒属Betanodavirus科，能在许多鱼类中传播。鱼类患病后出现神经紊乱症状，中枢神经系统和视网膜有局部空泡，并伴有螺旋式游泳，鱼鳔控制异常等表现。至今已从14个科30种以上的海洋鱼类体内分离出NNV。NNV基因组包含两条正义RNA连，其中RNA1编码一个RNA依赖的RNA聚合酶，RNA2编码病毒衣壳蛋白。在NNV基因所编码的蛋白中，衣壳蛋白具有免疫活性，可被用于制作疫苗。利用基因工程技术可在大肠杆菌中高效表达病毒衣壳蛋白，然而，由于原核细胞结构简单，通常在大量表达的同时不能使NNV衣壳蛋白正确折叠，最终呈包涵体形式存在，成为NNV疫苗开发的一大障碍。克服这一问题是当前石斑鱼神经坏死病的免疫防治迫切需求。

发明内容

一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，其特征在于，包

含以下步骤：

(1)将含有斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因的重组质粒pET32a-NNV转化到大肠杆菌BL21中，37℃、250rpm条件下，当OD达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为1mM，降温至25℃，诱导表达12h；

(2)诱导表达完成后离心收集菌体，破碎，对包涵体进行纯化，将纯化后的包涵体冷冻干燥，碾磨成粉末，过80目筛。

进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白大小为37kDa。

进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列为Seq ID No1。

进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白序列为Seq ID No2。

进一步的，所述步骤(2)中离心是在10000rpm转速下离心20min，弃上清。

进一步的，所述步骤(2)中破碎是将收集的菌体用裂解液重悬后采用高压均质机破碎，每次破碎压力为1000bar，时间为10min，共破碎3次。

进一步的，所述裂解液组成为：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl、125mM咪唑。

进一步的，所述步骤(2)中，石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白包涵体纯化步骤为：(1)取破碎后的菌体在20000rpm条件下离心30min后弃去上清，沉淀加入缓冲液B1，混匀后25℃振荡30min；(2)20000rpm离心30min后弃去上清，加入缓冲液B2，混匀后25℃振荡30min；(3)20000rpm离心30min后弃去上清，加入纯水，混匀后25℃振荡30min；(4)重复步骤(3)两次；(5)20000rpm离心30min后弃去上清，沉淀冷冻干燥后碾磨成粉末。