[发明专利]一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用有效
| 申请号： | 201611159701.5 | 申请日： | 2016-12-15 |
| 公开（公告）号： | CN106591328B | 公开（公告）日： | 2019-07-05 |
| 发明（设计）人： | 袁于人;殷波;陆洲 | 申请（专利权）人： | 斯澳生物科技（苏州）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/40 | 分类号： | C12N15/40;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/14 |
| 代理公司： | 苏州国诚专利代理有限公司 32293 | 代理人： | 韩凤 |
| 地址： | 215123 江苏省苏州*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 衣壳蛋白 石斑鱼 神经坏死病毒 大肠杆菌 黄粉虫 虫体 制备 生物技术领域 衣壳蛋白基因 融合基因 重组载体 包涵体 坏死病 碾磨 喂食 免疫力 应用 诱导 食用 神经 饲料 转化 | ||
1.一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)将含有石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因的重组质粒pET32a-NNV转化到大肠杆菌BL21中，37℃、250rpm条件下，当OD600达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为1mM，降温至25℃，诱导表达12h；
(2)诱导表达完成后离心收集菌体，破碎，对包涵体进行纯化，将纯化后的包涵体冷冻干燥，碾磨成粉末，过80目筛；
所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白大小为37kDa；
所表达石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的基因序列为Seq ID No1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所表达石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白序列为Seq ID No2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中离心是在10000rpm转速下离心20min，弃上清。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中破碎是将收集的菌体用裂解液重悬后采用高压均质机破碎，每次破碎压力为1000bar，时间为10min，共破碎3次；
其中，所述裂解液组成为：10mM的pH为 7.1的Tris-HCl、100mM NaCl、125mM咪唑。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白包涵体纯化步骤为：(1)取破碎后的菌体在20000rpm条件下离心30min后弃去上清，沉淀加入缓冲液B1，混匀后25℃振荡30min；(2)20000rpm离心30min后弃去上清，加入缓冲液B2，混匀后25℃振荡30min；(3)20000rpm离心30min后弃去上清，加入纯水，混匀后25℃振荡30min；(4)重复步骤(3)两次；(5)20000rpm离心30min后弃去上清，沉淀冷冻干燥后碾磨成粉末。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液B1组成为：10mM 的pH为7.1的Tris-HCl、100mM NaCl、1％TritonX-100；缓冲液B2组成为：10mM 的pH为 7.1的Tris-HCl、100mMNaCl。
7.根据权利要求1-6任一项所述的衣壳蛋白的应用方法，其特征在于，将所述衣壳蛋白粉末添加到饲料中，喂食3龄期黄粉虫，培养至4龄期时，将虫体冷冻干燥并碾磨成粉末，并过80目筛，即得抗神经坏死病毒天然药剂。
8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述抗神经坏死病毒天然药剂的应用方法为，将衣壳蛋白粉末按黄粉虫平均体重的1％添加到饲料中。
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