[发明专利]一种采用双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒

说明书

本发明公开一种采用双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，包括：21对特异性引物的复合引物组、复合扩增21个基因座、反应混合液以及热启动Taq酶；标记引物5’端第一个碱基用常规染料标记，引物5’和3’中间某个碱基用短激发波长荧光染料标记，以实现荧光能量转移。本发明的扩增结果更加稳定均衡，同时具有更高的灵敏度，可广泛应用于中国人群的个体识别、DNA建库和亲子鉴定，适用于各类检材。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种采用双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及其应用。

背景技术

STR遗传标记又称微卫星DNA，其广泛存在于原核及真核生物基因组中，是一类由2～6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列。不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。

个体识别DNA荧光检测试剂盒主要采用目前应用最为广泛的多重PCR复合扩增和多色荧光标记毛细管电泳检测技术，用于生物学检材的DNA基因分型。根据国内外已有的和我们自己在STR基因座方面的研究成果，并依据这些基因座在人群中等位基因频率分布的特点，我们选择在人群中具有较高的多态性和杂合度的基因座，在这些基因座附近设计引物并分别在引物上标记荧光素，通过多重PCR扩增体系，对多态性STR基因座进行特异性扩增，然后与已知长度并标有荧光素的分子量标准品混合，在遗传分析仪或测序仪上电泳并收集电泳信息，继而对STR基因座的PCR产物分别进行长度和基因型分析，获取所需数据，达到个体识别的目的。

目前市场上国产试剂盒一般采用FAM、HEX、TAMRA、ROX、ATTO633对引物和内标进行标记，测序仪采用的是单一激光，波长为488nm，而FAM，HEX，TAMRA，ROX和ATTO633这5种荧光染料激发波长却分布在500nm-650nm。随着染料激发波长的变大，相同量荧光标记产物，被测序仪激光激发产生的荧光信号逐渐减少，TAMRA和ROX荧光效率远远低于FAM、HEX。特别的，ROX染料标记比FAM标记，相同量的产物，信号强度只有四分之一到八分之一，在这样大的荧光效率差异下，获得各个荧光通道间的较好的均衡性以及较高的灵敏度变的很困难。本发明使用一种双荧光标记方法，可以实现荧光能量转移(FRET,fluorescence energytransfer)。

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当一个荧光分子(又称为供体)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈显著减弱。供体和受体之间FRET的效率，可以由E＝1/1+(R/R0)⁶反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径，依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。

目前市场上同类型的常染色体STR试剂盒见表1，本发明与Promega公司的PowerPlex21基因座的选择完全一致，21个基因座包含了13个CODIS和新增的4个CODIS位点，3个在中国人群中具有很高多态性的Penta D，Penta E和D6S1043，以及一个性别识别位点Amelogenin。既包含了所有CODIS基因座，又选择了3个高多态性的基因座，提高了整体的分辨率。这21个基因座也是目前能够录入常染色体数据库的所有的21个基因座，所以，选择这21个基因座是目前性价比最高的方案。表1与市面上主流商业化常染色体STR荧光检测试剂盒基因座对比。注：粗体的为13个CODIS基因座，下划线的为4个新增CODIS基因座。

发明内容