[发明专利]特异性识别及灵敏检测人血清蛋白的荧光试剂合成方法

说明书

本发明属于生物大分子探针领域，特别涉及测定人血清蛋白及高效快速鉴别其与牛血清蛋白的荧光试剂及方法。应用一种基于三苯胺和15‑冠‑5醚结构设计合成的具有典型的扭转的分子内电荷转移特征的席夫碱类有机化合物，作为荧光试剂，在中性磷酸盐缓冲溶液中，加入蛋白，通过化合物荧光光谱特征可以从几种常见蛋白中快速鉴别人血清蛋白，并且建立了标准曲线，可以定量测定生理缓冲液以及人工尿液中血清蛋白的含量。探针试剂的浓度50μM，能对5μM的人血清蛋白进行识别。生理缓冲液中定量检测人血清蛋白范围0‑5.6μM，最低检测限0.112 mg/L；人工尿液中范围0.0‑1.2μM，最低检测限1.95 mg/L。

技术领域

发明涉及到一种荧光探针法测定人血清蛋白浓度及识别其与牛血清蛋白的方法，属于生物大分子含量及结构研究领域。

背景技术

在临床诊断中，尿液中人血清蛋白的识别鉴定是肾脏疾病的早期信号，并且人血清中蛋白含量的不足也能预示提示肝功能的衰竭。除此之外，在生物化学或药理学应用领域，低成本的牛血清白蛋白(BSA)被广泛用来替代人血清白蛋白(HSA)。然而，牛血清白蛋白只有75.8％的生物功能与人血清白蛋白相似，是不能代替人血清蛋白去替换流体并帮助手术患者修复血容量的。因此，在治疗过程中区分人血清蛋白和牛血清蛋白，同时实现对蛋白含量的定量检测就显得尤为重要。目前，针对白蛋白检测的免疫化学方法层出不穷，但多数由于程序较为复杂且试剂和仪器较昂贵，不利于日常检测。而随着科学技术的发展，操作简单，灵敏度高且无破坏性的非共价荧光探针技术受到了广泛关注。

本文报道了一个合成简单，成本低廉的荧光探针，DB-15C5。DB-15C5具有典型的扭转的分子内电荷转移特征，因此在生理缓冲体系(PBS缓冲液)中几乎没有荧光，若一旦进入到HSA或者BSA结构中，就会发出绿色荧光，而对比其他几种蛋白并没有明显现象。DB-15C5与HSA结合后的荧光强度远远高于与BSA结合的荧光强度，紫外灯下照射就可以看出其区别，可以实现快速鉴别人血清蛋白和牛血清蛋白。荧光强度与HSA浓度之间存在很好的剂量关系，可以作为一种灵敏的HSA识别探针试剂，定量测定生理缓冲液以及人工尿液中血清蛋白的含量。探针试剂的浓度50μM，能对5μM的人血清蛋白进行识别。生理缓冲液中定量检测人血清蛋白范围0-5.6μM，最低检测限0.112mg/L；人工尿液中范围0.0-1.2μM，最低检测限1.95mg/L。此类方法较为直观，具有操作简单，灵敏度高和成本低廉等特点，值得推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，灵敏度高和成本低廉的荧光探针法测定人血清蛋白浓度及鉴别其与牛血清蛋白。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

(1)合成荧光探针试剂DB-15C5：称量二苯氨基-4-苯甲醛0.27g(1mmol)，加入50毫升三颈瓶中，温度设定为85℃，加入无水乙醇，加热回流至刚好全溶。称量4-氨基苯并-15-冠-5-醚0.28g(1mmol)，加入无水乙醇溶解，缓慢滴加到醛溶液中，冷凝回流4h，反应完成后静置过夜，析出黄绿色晶体，过滤，真空干燥得到产物DB-15C5。

(2)荧光识别HSA测定方法：取DB-15C5母液10μL于石英荧光比色皿中，再加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10^-5mol/L的待测液。加入蛋白储备液200μL，在荧光分光光度计上设置360nm为激发波长，磷酸盐缓冲液体系激发和发射狭缝调为2.5，5nm，人工尿液体系均为2.5nm。得到DB-15C5在不同蛋白存在时的荧光光谱。

(3)定量测定HSA含量：通过DB-15C5在不同浓度HSA存在时的荧光光谱，固定发射波长500nm，读取荧光强度，以荧光强度(I)对HSA浓度(C_HSA)作图，建立得到标准曲线。测定DB-15C5在未知样品中的荧光强度，通过标准曲线得到HSA含量。