[发明专利]一种猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法

说明书

本申请为专利申请201010210104.7的分案申请，原案申请日为2010年6月22日，原案发明名称为“一种猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法”。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起仔猪断奶多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。自1991年在加拿大猪群中暴发以来，PMWS已经波及全球，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2还与增生性坏死性肺炎、母猪繁殖障碍、猪皮炎与肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征相关。猪圆环病毒相关疾病(PCV2Associated Disease，PCVD)，主要是PMWS，在2005年给欧洲造成的损失高达6亿欧元。PCV2感染性疾病引起死亡率增高、饲料报酬降低，加上我国规模化猪场饲养管理水平相对较为落后，因此PCVD也给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。

目前，国际上上市的PCV2疫苗分为灭活疫苗、亚单位疫苗和嵌合灭活苗。PCV2疫苗效力检验方法通常是采用仔猪攻毒实验的方法。而我国猪群PCV2污染严重，对于筛选出合格的用于PCV2疫苗开发或者疫苗效力检验的实验猪比较困难，而且仔猪攻毒实验方法存在费时、费力、费钱及PCV2攻毒模型建立困难、检验结果批间差异大等问题。

发明内容

鉴于此，本发明通过猪圆环病毒2型疫苗免疫小白鼠，测定其血清中PCV2特异性抗体水平，提供了一种简捷有效的PCV2疫苗效力检验方法。包括下述步骤：

1.小白鼠的免疫

将猪圆环病毒2型疫苗经皮下免疫小白鼠，10-21天后再按照相同的免疫途径和剂量进行加强免疫一次；

2小白鼠抗体水平的测定

加强免疫14-28天后，处死小白鼠，采集并分离血清，测定抗体水平；

本发明所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的检验方法中，所述小白鼠的免疫剂量为0.1-0.2ml，并且分4点免疫。

本发明所述的猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法中，所述小白鼠抗体水平的测定方法包括如下操作步骤，

①将待检血清用PBS做倍比稀释；

②加入已经包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶标板中；

③放入37℃温箱，作用1h；

④弃去一抗，PBST洗涤；

⑤加入PBS稀释的HRP标记羊抗鼠IgG(二抗)，放入37℃温箱，作用1h；

⑥弃去二抗，用PBST洗涤；

⑦加入显色液进行显色；

⑧加入终止液终止显色；

⑨酶标仪读取OD₄₅₀，判定疫苗效力；

所述稀释液、洗涤液、显色液、终止液均为现有技术的常规用液。

最优地，本发明所述的首次免疫小白鼠的时间为14天。

最优地，本发明所述的加强免疫小白鼠的时间为21天。

本发明具有如下技术效果：

1.检测时间短，比猪体内效力检验的时间至少减少20天；

2.本发明方法操作简单，可重复性好，结果准确。

3.小白鼠遗传稳定，不会出现实验动物个体差异而引起的实验结果差异显著；

4.用疫苗免疫小白鼠操作简单，同时不需要买大量的实验猪，大大节约了成本、人力，提高了疫苗检测的效率。

具体实施方式

本发明的实施例中利用平行实验的方法建立了免疫小白鼠抗体水平、免疫猪抗体水平及仔猪攻毒保护的关系，发现免疫小白鼠抗体水平与免疫后猪的抗体水平及攻毒后淋巴结感染存在平行关系。应用本发明的方法，可以替代通常采用的PCV2疫苗免疫猪抗体水平实验以及仔猪攻毒保护实验。本发明实施例中还利用本发明检测方法制定出PCV2疫苗效力的合格标准，为PCV2疫苗的大规模生产和检测提供了基础。

实施例1

猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的检测

1.灭活疫苗来源

PCV2灭活疫苗的毒株为PCV2-SH株(保藏号CGMCC No.2389)。将PCV2-SH株接种PK15细胞，5天后收获病毒抗原液做为灭活疫苗。