[发明专利]由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了由基因工程化的人造抗原提呈细胞aAPC的分泌小体囊泡，exosome所构建的T细胞疫苗的制备及应用。本发明通过转染两种真核表达质粒载体pcDNA_HLA‑A2、pcDNA_CD80和感染两种重组腺病毒载体AdV_Gag、AdV_41BBL，构造了一种基因工程化的K562_{A2/Gag/CD80/41BBL}aAPC。然后通过差速超高速离心法从K562_{A2/Gag/CD80/41BBL}培养上清液中纯化exosomes，并进行电子显微镜和免疫印迹分析。这些exosomes通过孵育和Con‑A刺激的HLA‑A2转基因小鼠的非特异性T细胞共孵育而构建了具有HLA‑A2限制性的和Gag特异性的Gag‑Texo疫苗。本发明用无限来源的不断生长的人工抗原提呈细胞aAPCK562_{A2/Gag/CD80/41BBL}囊泡替换有限来源的DC囊泡用于制备HIV‑1Gag特异性T细胞疫苗。这种新颖的使用基因工程化抗原提呈细胞的囊泡制备T细胞疫苗的方法将对HIV‑1患者临床治疗性疫苗的研制具有重要的影响。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法及应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-I)感染病人的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，是一种迅速扩大的全球大流行性疾病。有效的抗病毒疗法(HAART)能成功抑制病毒的复制，显著改善病人的预后[1]。然而，它不能恢复抗HIV-1免疫反应。在炎症慢性期的药物治疗并不能逆转由病毒引起的CD4⁺T细胞和CD8⁺效应T细胞的衰退，从而导致HIV-1病毒的潜伏[2]。因此，迫切发展在药物间断治疗过程中提高对病毒控制的新治疗策略具有现实意义，从而使病人可避免对药物的长期使用，进而减少其毒性和治疗成本。

树突状细胞(DC)是体内最有效的抗原提呈细胞(APC)。他们已被用作疫苗在动物模型[3]和艾滋病患者临床试验[4,5]中刺激HIV特异性CTL反应。在这些试验中发现，安全状况良好，仅有轻微的局部副作用。然而，可能是由于缺陷的免疫系统如CD4⁺T细胞的帮助不足，由DC疫苗引起的HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应通常仅能低效率控制艾滋病患者的进展，因而需要探索一种更有效的HIV特异性治疗性细胞疫苗。

我们以前通过Con-A刺激的非特异性T细胞摄取重组Gag表达腺病毒(AdV_Gag)感染的DC(DC_Gag)所释放的分泌小体(囊泡)EXO_Gag，开发了HIV-1 Gag蛋白特异性树突状细胞(DC)分泌小体亦称囊泡(exosomes；EXO)靶向的T细胞(Gag-Texo)疫苗，并表明Gag-Texo相较DC疫苗能够不依赖宿主CD4⁺T细胞的帮助而刺激CTL反应并能逆转CD4⁺25⁺FoxP3⁺调节性T细胞的免疫抑制，从而能更有效的刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和治疗性免疫反应[6]。为了提高其免疫原性，我们进一步构造了4-1BBL表达的Gag-Texo疫苗，并证明了它具更有效的诱导HLA-A2转基因小鼠的CTL反应和治疗性抗肿瘤免疫[7]。我们最近的研究表明，Gag-Texo疫苗能通过CD40L-mTORC1途径抵抗慢性炎症介导的T细胞无能和逆转CTL耗竭[8]，提示我们的Gag-Texo新疫苗可能成为治疗性HIV-1疫苗。然而，获得大量自体树突状细胞的技术难点显著限制了DCs或DC释放的囊泡在临床免疫治疗中的应用[9,10]。当然亦将限制DC释放的囊泡所构造的囊泡靶向的T细胞疫苗在临床免疫治疗的应用。