[发明专利]一种通过去热原纯化降纤酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说涉及一种纯化降纤酶精品的方法。

背景技术

蛇毒中的降纤酶是哺乳动物凝血及纤溶系统的蛋白酶。通过专一性的激活或灭活作用, 该蛋白酶作用于血液凝固、纤溶系统的各个步骤, 产生促凝或抗凝效应。在体外引起血浆纤维蛋白原的凝聚, 起凝血作用; 在体内它不激活凝血因子XIII。所有它有分解血浆纤维蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力的作用。在临床上蛇毒类凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性脑梗死，以及脑梗死再复发的预防等。

热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。当含有热原的物质进入人体以后，人体会产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此去热原是很多药用生化产品生产工序中不可缺少的一步。细菌内毒素法是常用的控制热原的检测方法之一。

天然蛇毒中提取的类凝血酶绝大多数为酸性蛋白质，经对现有文献的检索发现，从蛇毒种制备降纤酶多采用阴离子交换柱进行分离，并结合凝胶过滤、亲和层析和反相液相色谱等方法进行纯化。虽然在一定程度上实现了规模化生产，取得了单一成分产品,但是比活更高、去除热原的降纤酶单一成品的获得使降纤酶的应用更加安全，同时更能满足临床和科研的需求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种通过去热原纯化降纤酶的方法。取得比活更高、去除热原的单一成分降纤酶产品，使其能够快速、简便、低成本的纯化降纤酶。

本发明是通过以下技术方案实现的，其步骤如下：

（1）将降纤酶干粉按1:10-30(Kg:L)的比例加入纯化水中搅拌溶解后，加入等体积的乙醇以及总体积的5％ (L:Kg) 的乙酸铵搅拌。

（2）按降纤酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.1-0.4mol/L 磷酸钾溶液，搅拌30分钟后，再按降纤酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.05-0.3mol/L的乙酸钙溶液，搅拌均匀。

（3）用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH 至9.0-10.0，搅拌2-3小时；3000rpm离心30分钟，弃去沉淀物取上清液。

（4）上清液用2mol/L的盐酸溶液调节pH 至7.5-8.5，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，静置过夜。

（5）虹吸上层废乙醇，收集沉淀，3000rpm离心30分钟。

（6）沉淀物用无水乙醇脱水，3000rpm离心30分钟。

（7）将沉淀物置五氧化二磷为干燥剂的真空干燥箱中干燥，即得降纤酶成品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

（1）将降纤酶干粉按1:15(Kg:L)的比例加入纯化水中搅拌溶解后，加入等体积的乙醇以及总体积的5％ (L:Kg) 的乙酸铵搅拌。

（2）按降纤酶干粉1:15(Kg:L)的比例加入0.2mol/L 磷酸钾溶液，搅拌30分钟后，再按降纤酶干粉1：30(Kg:L)的比例加入0.1 mol/L的乙酸钙溶液，搅拌均匀。

（3）用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH 至9.2，搅拌2.5小时；3000rpm离心30分钟，弃去沉淀物取上清液。

（4）上清液用2mol/L的盐酸溶液调节pH 至7.8，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，静置过夜。

（5）虹吸上层废乙醇，收集沉淀，3000rpm离心30分钟。

（6）沉淀物用无水乙醇脱水，3000rpm离心30分钟。

（7）将沉淀物置五氧化二磷为干燥剂的真空干燥箱中干燥，即得降纤酶成品。

得到的降纤酶成品检测纯度为98.2%，比活力为4090单位/mg，细菌内毒素小于0.01EU/U。

实施例2

（1）将降纤酶干粉按1:25(Kg:L)的比例加入纯化水中搅拌溶解后，加入等体积的乙醇以及总体积的5％ (L:Kg) 的乙酸铵搅拌。