[发明专利]一种脯氨酸蛋白酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种脯氨酸蛋白酶突变体及其应用。本发明通过定向进化技术筛选获得的脯氨酸蛋白酶突变体，其最适反应pH值为4.0，最适反应温度为55℃，且在45‑60℃范围内均能保持80%以上的酶活，耐热性显著高于野生型。所述突变体可广泛应用于啤酒生产中，能显著降低啤酒的浊度。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一种脯氨酸蛋白酶突变体应用。

技术背景

脯氨酸蛋白酶，也称脯氨酰内肽酶(简称PEP)或脯氨酰寡肽酶，属于丝氨酸蛋白酶中一种新的家族，该家族能专一性地水解多肽中脯氨酸残基的羧基端肽键，含有典型的丝氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位点Ser周围的氨基酸残基和其他典型的丝氨酸蛋白不同，而且与已知的丝氨酸蛋白酶家族(包括胰蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶Y)相比，在一级结构上同源性很低。

脯氨酸蛋白酶不仅能降解催产素，还可以降解许多催产素类似物，抗利尿激素的降解也是由于脯氨酸羧基端肽键的断裂而形成的。此外，很多肽类激素的也是由于脯氨酸残基的羧基端肽键以相同的方式被断裂而灭活的。相反，人体的胃泌素，促肾上腺皮质激素和豚鼠的胶原蛋白却不能被这类酶所降解，脯氨酸蛋白酶也不能够降解很多分子量比较大的蛋白质和多肽，例如血清蛋白、IgG、弹力蛋白、明胶、酪蛋白，促肾上腺激素释放激素，泛素和蛋白酶抑制剂等。根据对脯氨酸蛋白酶降解的多种肽类激素和人工合成多肽的分析，发现不同来源的脯氨酸蛋白酶可以专一性降解肽链内Y-Pro-Y'中的顺式结构Pro-Y'键，Y'可以是除脯氨酸之外的氨基酸、多肽、酰胺、芳香胺或者醇类化合物。

在食品与发酵工业，脯氨酰蛋白酶是一种有价值的酶类，如能通过水解啤酒中富含脯氨酸的蛋白多肽，阻止其与多酚类物质形成大聚合物浑浊沉淀，从而提高啤酒的非生物稳定性。已有报道证明脯氨酸蛋白酶在蛋白水解物中的去苦味作用。此外，鉴于脯氨酸蛋白酶的特异性，该酶还有可能作为一种分子生物学的工具酶，用于蛋白质序列测定、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等。

作为一种非常重要的工业用酶，脯氨酸蛋白酶目前主要应用在食品加工业和啤酒酿酒业，尤其在啤酒生产和面包制造业应用很突出。脯氨酸蛋白酶可以降解啤酒中的浑浊敏感蛋白的脯氨酸而使其失活，在不影响发酵性能的前提下，显著性的提高了啤酒的非生物稳定性。

在工业生产中，追求微生物最大化表达量的酶，提高酶的特定性质的意义重大，不仅可以显著降低生产成本，并减少能源消耗和环境污染。一般情况下，除了通过传统菌种诱变方法提高微生物表达量，还可以通过基因工程手段如突变、利用强启动子、多拷贝基因、合适的信号肽等改造其性能及表达量。因此，通过筛选或改造的方法获得性能优良的脯氨酸蛋白酶成为本领域内的研究热点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型的脯氨酸蛋白酶突变体及其应用。所述突变体是申请人通过定向进化技术筛选获得的，其耐热性显著高于野生型，有利于脯氨酸蛋白酶的广泛应用。

本发明一方面提供了一种脯氨酸蛋白酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

所述脯氨酸蛋白酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面提供了一种脯氨酸蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脯氨酸蛋白酶的第101位氨基酸由Gly变为Glu，第146位氨基酸由Val变为Ile，第441位氨基酸由Arg变为Trp。

所述脯氨酸蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面提供了一种重组质粒，其携带有编码序列为SEQ ID NO：4的脯氨酸蛋白酶突变体的基因。

本发明还提供了一种重组菌株，是通过将上述重组质粒转化入黑曲霉(Aspergillus niger)中获得的。