[发明专利]高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法

权利要求书

1.一种以高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)接种：向装液量为40％～42％的发酵罐中，以接种量6～8％接入E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G的种子培养液，设置初始pH为6.8～7.2，培养温度为36～37℃，初始转速180～200r/min，通气量为4.8～5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在28～30％；

(2)补料：在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.18～0.2h^-1进行指数流加补料培养基；

(3)诱导：当OD₆₀₀达到58～62时，调整温度为28～30℃，以0.20～0.22g/(L·h)的恒速流加140～150mL的诱导剂；

(4)合成烟酰胺：调整温度为25～28℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD₆₀₀＝150～160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，整个发酵过程中，控制pH为6.8～7.2。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，整个发酵过程中通过流加25％的氨水调节pH，使罐内pH始终维持在6.8～7.2。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)，向装液量为40％的发酵罐中，以接种量6％接入种子培养基，设置初始pH为7，培养温度为37℃，初始转速200r/min，通气量为5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在30％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)，在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.2h^-1进行指数流加补料培养基。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)，当OD₆₀₀达到60时，调整温度为30℃，以0.22g/(L·h)的恒速流加150mL的诱导剂。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)，调整温度为28～30℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD₆₀₀＝160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基按g/L计：葡萄糖12.0，磷酸二氢钾13.5，磷酸氢二铵4.0，柠檬酸1.7，硫酸镁1.68，微量元素10mL；微量元素按g/100mL计：七水硫酸亚铁1.0，七水硫酸锌0.525，五水硫酸铜0.3，四水硫酸锰0.05，硼砂0.023，氯化钙0.2，钼酸铵0.01。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，补料培养基按g/L计：葡萄糖500.0，硫酸镁7.33，酵母提取物4.0，胰蛋白胨4.0。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导剂按g/100mL计：乳糖10.0，CoCl₂·6H₂O 0.8。