[发明专利]敲减人PD-1的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种敲减人PD‑1的siRNA、重组表达CAR‑T载体及其构建方法和应用。本发明所述的PD‑1敲减siRNA表达框及其siRNA表达产物，不仅可以应用于CAR‑T治疗多发性骨髓瘤(MM)中用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制，还可应用于抑制CAR‑T治疗诸如胰腺癌、脑胶质瘤、骨髓瘤等等类型肿瘤时的免疫逃脱机制。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种敲减人程序性死亡受体1(PD-1)的siRNA、重组表达CAR-T载体(尤其是一种通过敲减PD-1消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制的CAR-T转基因载体)及其构建方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。

2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用CLT019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。CAR-T细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。

CAR-T疗法虽然效果显著，但是在治疗实体肿瘤的过程中遇到很多困难，其中一个很重要的原因就是PD1/PDL1抑制性免疫检查点(如图1所示)，它们结合传递抑制信号，抑制了T细胞的免疫活性，在免疫耐受中发挥了重要作用，同时也是促使肿瘤细胞逃逸的重要原因。

PD-1(又称CD279)是一种免疫抑制性受体，属于CD28家族成员的Ⅰ型跨膜蛋白，程序性细胞死亡分子-1受体1992年由Ishida等[Ishida Y,Agata Y,Shibahara K,etal.Induced expression of PD-1,a novel member of the immunoglobulin genesuperfamily,upon programmed cell death〔J〕.EMBO J,1992,11(11):3887-3895.]采用消减杂交方法于凋亡的T细胞杂交瘤中得到并命名。人PD-1基因位于2q37.35染色体上，编码一个约55kD的跨膜糖蛋白。PD-1在激活的T细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞表面广泛表达，PD-1结构上与CTLA-4有30％的同源性，胞内区存在两个酪氨酸残基，分别参与构成了N端的一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitorymotif，ITIM)和C端的一个免疫受体酪氨酸依赖的转换基序(immunoreceptor tyrosin-based switch motif，ITSM)；胞外区则是由一个IgV样结构域组成，含有多个糖基化位点并被重度糖基化，该结构域可以与配体结合，从而发挥抑制T细胞活化的功能[李瑛,焦顺昌等.PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫逃逸中的作用及临床意义[J].Acad J Chin PLA MedSch,Jul 2015,36(7).]。