[发明专利]敲减人PD-1的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种敲减人PD-1的siRNA，所述siRNA选自下述中的a-b中的任一对：

a.SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；

b.SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的siRNA在制备消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制药物中的应用。

3.一种包含权利要求1所述的siRNA的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的慢病毒表达载体包括：用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.1所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQ ID NO.11所示；用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.12所示；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQ ID NO.15所示；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的抗BCMA嵌合抗原受体的编码基因；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQ ID NO.13所示；用于胞内转录siRNA的人RNA聚合酶III启动子hU6，如SEQ ID NO.14所示。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件。

7.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV启动子。

8.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。

9.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述抗BCMA嵌合抗原受体，包括依次串联的如SEQ ID NO.16所示的CD8 leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.17所示的BCMA单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.18所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.19所示的BCMA单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.20所示的CD8 Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.21所示的CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.22所示的CD137嵌合受体共刺激因子，以及如SEQ ID NO.23所示的TCR嵌合受体T细胞激活域。